金 鵬 申星花 李學奇 (哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院心內科，黑龍江 哈爾濱 150001)

細胞移植療法治療冠心病雖然取得了一定的療效，但是還存在著許多限制和難題，最主要的問題就是移植細胞種類的確定和轉化效率的高低。P19細胞是從C3H/He雄性小鼠畸胎瘤中分離得到的一種能在體外培養(yǎng)的多能干細胞。一系列研究表明，P19 細胞在二甲基亞砜(DMSO)〔1〕或 5-氮胞苷(5-Aza)〔2〕的誘導下可以轉化為心肌樣細胞。本實驗選取上述兩種誘導劑分別誘導P19細胞，觀察其誘導效率。

1 材料與方法

1.1 材料 P19細胞系購自上海拜力生物科技有限公司;DMSO，5-Aza(Sigma公司);α-MEM(Hyclone公司);胎牛血清、胰蛋白酶(杭州四季青生物公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，UV-530紫外分光光度計(上海生物儀器廠)，PCR儀(美國Hybad公司)。

1.2 方法

1.2.1 P19細胞的培養(yǎng) 將P19細胞凍存管從液氮中取出，放入37℃溫水中浸泡2 min，待其溶化后移入離心管，以1 000 r/min速度離心5 min，吸除上清液，向管內加入10 ml α-MEM培養(yǎng)液(含青霉素1萬U/L、100 ml/L胎牛血清、鏈霉素100 mg/L，配置成pH7.2～7.4)重懸細胞，重復離心操作，吸除上清液。加入4 ml培養(yǎng)液重懸。置于37℃、體積分數為0.05的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。正常培養(yǎng)的P19細胞2～3 d傳代1次，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，擴增培養(yǎng)。

1.2.2 P19細胞的誘導分化 取復蘇后傳5代的貼壁細胞，用磷酸鹽緩沖液沖洗，以1∶1的比例取0.2 g/L EDTA和2.5 g/L的胰酶進行消化后，將密度為1×106個/L細胞接種在底部鋪有一薄層5 g/L瓊脂的10 cm2的細菌培養(yǎng)皿中，DMSO組以終濃度1.0%進行分化培養(yǎng)。5-Aza組以終濃度10 μmol/L進行分化培養(yǎng)。每2天更換一次普通培養(yǎng)液，并使用倒置顯微鏡對細胞的生長及形態(tài)變化進行觀察。

1.2.3 RT-PCR分析GATA-4基因相對表達量 用Trizol法提取總RNA，測定A260/A280比值為1.8以上可用。小鼠心肌細胞標記物GATA-4上游引物5'-CCCTACCCAGCCTACATGG-3'，下游引物5'-ACATATCGAGATTGGGGTTGT-3'，產物271 bp。內參照物β-actin，上游引物5'-GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3'，下游引物5'-TTGATGTCACGCACGATTT-3'，產物450 bp。循環(huán)參數為：預變性95℃ 5 min，變性94℃ 2 min，退火62℃ 40 s，延伸72℃ 40 s，循環(huán)32次。最后72℃延伸5 min。電泳分析擴增結果，凝膠圖像分析系統(tǒng)采集圖像并照相記錄。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡觀察 三組研究對象在復蘇后未分化的細胞均呈均勻、分散狀態(tài)，3～4 h細胞貼壁，24 h半鋪瓶底，48 h后細胞滿布瓶底。DMSO和5-Aza組誘導4 d后，細胞均以克隆集落方式增殖，細胞形態(tài)呈現多樣化，梭形細胞明顯增多。8 d出現自發(fā)性節(jié)律收縮的心肌樣細胞。誘導后2 w，5-Aza組分化細胞明顯多于DMSO組。見圖1。

2.2 誘導后心肌早期基因GATA-4的表達情況 除陰性對照組外，其他兩組均表達心肌早期分化基因。見圖2。每組15 d后表達量與本組7 d表達量相比較均明顯增加。此外，5-Aza組誘導28 d基因表達量明顯高于DMSO組28 d。見表1。

圖1 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)(×100)

表1 各組GATA-4 mRNA相對表達量比較(s)

表1 各組GATA-4 mRNA相對表達量比較(s)

與本組7 d比較：1)P＜0.05;與DMSD組28 d比較：2)P＜0.05

7 d 15 d 28 d陰性對照組組別0 0 0 DMSO組 0.24±0.02 0.65±0.011) 0.99±0.021)5-Aza組 0.30±0.03 0.81±0.031) 1.25±0.011)2)

圖2 各組GATA-4表達情況

3 討論

干細胞的誘導分化是近年來生物醫(yī)學研究領域的熱點之一。P19細胞具有細胞分裂快，可在體外大量擴增，多向分化的潛能。本研究對不同誘導劑誘導P19細胞分化為心肌細胞的效率進行了分析。

目前發(fā)現有效的誘導劑主要為DMSO和5-Aza。DMSO具有抗氧化和抗炎作用，是發(fā)現較早的誘導劑之一，其作用機制主要是抑制c-myc基因表達，通過細胞內的鈣離子短暫增加，激活對心肌分化有利的信號通路實現〔3〕。有研究證實1.0%DMSO可以更有效地誘導P19細胞分化為心肌細胞〔4〕。5-Aza主要在骨髓間充質干細胞向心肌分化的研究中廣泛應用。在誘導單層P19細胞分化為心肌細胞中，5-Aza可能通過激活骨形態(tài)形成蛋白(BMP)信號途徑調節(jié)心肌特異轉錄因子的活化而引起心肌細胞的發(fā)生〔5〕。本研究選取DMSO和5-Aza的常用有效濃度進行比較分析發(fā)現，二者均可誘導成心肌細胞，但28 d時顯微鏡下觀察，5-Aza分化組的細胞數量多于DMSO組。兩組在培養(yǎng)7 d時就可以觀察到心肌特異性蛋白GATA-4的表達，而此時尚未出現細胞跳動，說明在心肌分化過程中，心肌特異蛋白的表達要早于心肌跳動的出現。GATA-4具有調節(jié)心肌發(fā)生、分化的作用，與心臟發(fā)育密切相關。本研究通過RT-PCR法檢測兩組GATA-4 mRNA的相對表達量，結果表明二者均轉化成功，并且隨著時間推移、轉化的數量增多。但是28 d時5-Aza分化組的表達量多于 DMSO組，說明5-Aza的轉化效率更強。

在干細胞治療領域，大量定向分化的細胞對疾病的治療至關重要。如何獲得更多的分化細胞是研究的重點之一。本研究為進一步開發(fā)出高效的誘導方式提供了參考。

1 李秀華，張 雷，王海萍，等.P19細胞體外DMSO誘導向心肌樣細胞分化〔J〕. 第四軍醫(yī)大學學報，2006;27(2)：129-32.

2 尹 青，趙 昱，陳 煒，等.應用5-氮胞苷體外誘導P19細胞分化為心肌細胞〔J〕. 解剖學報，2007;38(3)：325-9.

3 van der Heyden MA，Defize LH.Twenty one years of P19 cells：what an embryonal carcinoma cell line taught us about cardiomyocyte differentiation〔J〕.Cardiovasc Res，2003;58(2)：292-302.

4 尹 青，陳 煒，趙 昱，等.二甲基亞砜對P19細胞體外分化為心肌細胞的影響〔J〕.細胞生物學雜志，2007;4(29)：579-84.

5 Choi SC，Yoon J，Shim WJ，et al.5-azacytidine induces cardiac differentiation of P19 embryonic stem cells〔J〕.Exp Mol Med，2004;36(6)：515-23.