朱洋波 寧 丹 王 芬 朱德發(fā) (安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年內(nèi)分泌科，安徽 合肥 230022)

成年期甲狀腺功能減退 (甲減)可導(dǎo)致人或動物腦損傷以及學(xué)習(xí)記憶功能受損，受損的機制可能與甲狀腺激素缺乏所致的突觸可塑性改變有關(guān)〔1〕，后者被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)。突觸前膜列陣蛋白1(syntaxin-1)廣泛分布于正常大腦皮質(zhì)神經(jīng)元，是重要的突觸囊泡相關(guān)蛋白，位于神經(jīng)元的突觸前膜上，主要參與突觸囊泡膜的融合與遞質(zhì)釋放，并與突觸可塑性調(diào)節(jié)有關(guān)〔2〕。前額葉是與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的關(guān)鍵腦區(qū)，報道顯示成年大鼠額葉神經(jīng)遞質(zhì)釋放受甲狀腺激素的影響〔3〕，但相關(guān)機制報道較少。本研究通過腹腔注射丙硫氧嘧啶 (PTU)誘導(dǎo)建立成年期甲減大鼠模型，探討甲減對額葉內(nèi)syntaxin-1表達的影響及左旋T4替代治療后syntaxin-1的恢復(fù)程度。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康3月齡雄性SD大鼠45只，普通級，體質(zhì)量250～300 g，購自南京實驗動物中心，動物證號：SCXK(蘇)200220031。標(biāo)準(zhǔn)實驗條件下喂養(yǎng)，自然采光，所有大鼠接受標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類食物，自由進食、飲水。

1.2 主要儀器及試劑 EPS-300電泳儀、VE-180垂直電泳槽、VE-186轉(zhuǎn)膜電泳槽(上海天能科技有限公司)。PTU、左甲狀腺素(左旋T4，Sigma公司);T3、T4放射免疫試劑盒(北方生物技術(shù)研究所);山羊抗大鼠抗syntaxin-1蛋白多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗山羊IgG(Santa Cruz公司);HRP標(biāo)記的抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單抗(上?？党缮锕こ逃邢薰?。

1.3 模型制備 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機分為4組：甲減組(H組，n=11)，小劑量左旋T4替代治療組(T4-5組，n=12)、大劑量左旋T4替代治療組(T4-20組，n=12)、對照組(C組，n=10)。甲減組大鼠每日腹腔注射PTU 1 mg/100 g體重(BW)共6 w;左旋T4替代治療組大鼠每日腹腔注射 PTU 1 mg/100 g BW，第5周起小劑量組每日給予左旋T45 μg/100 g BW 2 w，大劑量組大鼠每日給予左旋T420 μg/100 g BW 2 w;對照組大鼠每日腹腔注射同體積生理鹽水6 w。每周測體重一次，并根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量。本實驗研究遵循“實驗用動物管理和使用指南”。

1.4 標(biāo)本制備 血清制備：造模結(jié)束24 h后，所有大鼠稱重，給予每100 g體重0.3 ml的水合氯醛麻醉后打開胸腔，腹主動脈取血，大約每只大鼠取血1.5 ml后，迅速以5 000 r/min離心10 min后，取血清置于-20℃冰箱保存待測T3、T4?？紤]到甲狀腺素分泌存在節(jié)律性，以隨機的方式在上午9：00～11：00完成所有大鼠的取血工作。取血后迅速將大鼠斷頭處死，冰上分離額葉組織，置于-80℃冰箱保存。

1.5 甲狀腺素水平測定 采用放射免疫法測定T3、T4水平。

1.6 突觸小體提取 取額葉置于玻璃勻漿器中，加入蛋白裂解液(10 mmol/L HEPES，1 mmol/L EDTA，10%sucrose，pH 7.4，蛋白酶抑制劑cocktail 2 μl/ml)，冰上勻漿。然后4℃下離心8 min，取上清離心15 min，所獲得沉淀即為粗制突觸小體，向沉淀中加入等體積上述蛋白裂解液重懸浮，用BCA法進行蛋白定量。將所有樣品中加入等量4×蛋白電泳加樣緩沖液(3∶1)，混勻，煮沸10 min，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Western印跡 各樣本分別取25 μg總蛋白依次進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(抗syntaxin-1蛋白多克隆抗體，1∶200)，室溫孵育2 h，0.05%PBS-T洗10 min×3次后加HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG和內(nèi)參抗體(HRP標(biāo)記的抗 GAPDH 抗體，1∶10 000)，室溫孵育 1.5 h，0.05%PBS-T洗10 min×3次，ECL顯色后曝光并顯影。對條帶進行相對光密度分析，通過syntaxin-1與內(nèi)參GAPDH的條帶光密度值的比值間接反映syntaxin-1的表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清T3、T4水平 與C組相比，H組大鼠血清T3、T4顯著降低(P＜0.05)，分別為對照組的 52.30%和77.92%;小劑量左旋T4替代治療后(T4-5組)，大鼠血清T3、T4恢復(fù)至正常水平(P＞0.05)，分別為對照組的96.92%和99.71%;而給予大劑量治療后(T4-20組)，大鼠血清T3、T4明顯增高(P＜0.01)，分別為對照組的170.8%和175.1%。見表1。

表1 各組大鼠血清T3、T4水平比較( s，nmol/L)

表1 各組大鼠血清T3、T4水平比較( s，nmol/L)

與對照組比較：1)P＜0.05，2)P ＜0.01

組別 n T3 T4 10 0.65±0.05 55.20±3.56 H組 11 0.34±0.042) 43.01±2.951)T4-5組 12 0.63±0.05 55.04±3.77 T4-20組 12 1.11±0.102) 96.68±6.422)C組

2.2 各組大鼠前額葉syntaxin-1表達的改變 甲減組大鼠額葉內(nèi) syntxin-1蛋白表達顯著減少(P＜0.05)，為對照組的74.58%。給予小劑量和大劑量左旋T4替代治療后，syntxin-1的表達分別為對照組的85.35%和100.54%，與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與甲減組比較，小劑量左旋T4替代治療后syntxin-1蛋白表達增加了10.77%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而大劑量治療后syntxin-1蛋白表達較甲減組增加了25.96%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 各組前額葉突觸小體內(nèi)syntaxin-1的表達

3 討論

維持成年期哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能的分子基礎(chǔ)可能受甲狀腺激素的影響，其中包括對突觸可塑性的調(diào)節(jié)以及一些重要突觸蛋白表達的調(diào)控〔4〕。突觸蛋白syntaxin-1是參與調(diào)節(jié)中樞系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的重要蛋白之一，報道顯示，成年期甲狀腺激素缺乏可影響syntaxin-1蛋白在大鼠腺垂體的表達，其表達量明顯下降〔5〕。本研究提示在成年期甲狀腺激素缺乏可影響syntaxin-1蛋白在前額葉內(nèi)的表達。甲減狀態(tài)下syntaxin-1蛋白的減少可能是由于甲狀腺激素缺乏所致的蛋白合成減少，另一方面可能與甲減引起的神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變有關(guān)。研究表明〔6〕在甲減狀態(tài)下大鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)元的樹突棘數(shù)量和密度減少。而Hepp等〔7〕發(fā)現(xiàn)syntaxin-1在成年甲減大鼠腎上腺組織內(nèi)的表達增加，這與甲減下此蛋白在腦內(nèi)表達的研究結(jié)果不一致，可能是由于不同的組織對甲狀腺激素缺乏的反應(yīng)性不同。

通過甲狀腺激素替代治療，甲減腦損傷分子水平的改變能夠得到恢復(fù)，但恢復(fù)程度存在爭議。本研究的結(jié)果提示左旋T4替代治療能夠使成年期甲減syntaxin-1蛋白表達恢復(fù)，劑量增加會使syntaxin-1蛋白的表達恢復(fù)得更好，相似的結(jié)果也出現(xiàn)在對前額葉其他蛋白、海馬內(nèi)突觸蛋白以及形態(tài)學(xué)研究中。而本課題組在同樣實驗條件下的研究顯示，甲減下海馬的munc-18〔8〕和 synaptotagmin-1〔9〕在甲狀腺激素恢復(fù)正常時的表達與對照組相比有顯著差異，劑量增加可以使上述蛋白表達水平與對照組相同，效果顯著，這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是大劑量T4替代治療可使甲狀腺激素更充分地占據(jù)核受體，從而更有效地發(fā)揮其生理活性。有文獻報道〔10〕甲減大鼠給予單次大劑量T3治療能使其核受體飽和度達到86%，而多次小劑量T3治療僅使其核受體飽和度達到49%。甲減腦損傷的形態(tài)學(xué)研究〔6〕也顯示，高劑量甲狀腺激素替代治療能夠使減少的樹突棘數(shù)目恢復(fù)至正常的88%，而低劑量僅能使其恢復(fù)至正常的68%，高劑量較低劑量明顯有效。另一方面，本文的治療時間為2 w，有研究顯示小劑量左旋T4替代治療6 w能使成年期甲減大鼠海馬依賴性的認(rèn)知缺損完全恢復(fù)，這可能提示成年期甲減腦損害的恢復(fù)亦與替代治療時間有關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果表明成年期甲減大鼠前額葉內(nèi)syntaxin-1蛋白表達減少;左旋T4替代治療能使其改善，當(dāng)血清甲狀腺激素替代至正常水平時，syntaxin-1蛋白的表達與對照組無顯著差異;替代治療至血清甲狀腺激素水平高于正常時，syntaxin-1蛋白的表達更接近于對照組。

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