朱詩平 孫升云 馮偉峰 何 鈴 金 鑫 聶玲輝 (暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 50632)

腎間質(zhì)纖維化是慢性腎臟病(CKD)的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，阻抑腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展對防治CKD意義重大〔1〕。腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin-system，RAS)在腎間質(zhì)纖維中發(fā)揮重要的作用〔2〕，其中血管緊系素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)能增加腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因子轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transition Growth Factor-β1，TGF-β1)的表達(dá)〔3〕。近年來新發(fā)現(xiàn)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin-Converting Enzyme，ACE2)可直接水解AngⅡ生成Ang(1-7)，同時還可以水解AngⅠ為Ang-(1-9)，后者隨后被ACE降解為Ang(1-7)，Ang(1-7)在體內(nèi)有著與AngⅡ相拮抗的生物學(xué)效應(yīng)，因此ACE2被認(rèn)為是一個防治CKD的新靶點(diǎn)〔4〕。本研究通過觀察氯沙坦對腺嘌呤致腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織ACE2 mRNA、TGF-β1 mRNA表達(dá)水平的影響，探討氯沙坦除拮抗AngⅡ1型受體(AT1R)外可能的抗腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠24只，SPF級，體重(180±20)g。廣東省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(粵)2008-0002。氯沙坦鉀片(科素亞、100 mg/片)，產(chǎn)品批號：09220，由杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)。腺嘌呤(adenine，C5H5N5，F(xiàn)W：135.14)由廣州生產(chǎn)威佳科技有限公司提供，純度大于98%。ACE2、TGF-β1、內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由上海生工生物工程有限公司合成。Trizol試劑盒由美國Invitrogen公司生產(chǎn)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑和PCR反應(yīng)試劑(SYBR Prime-ScriptTMRT-PCR Kit)由日本TaKaRa公司生產(chǎn)。9600PCR擴(kuò)增儀(美國PE公司)、Chronmo4全自動熒光定量PCR儀(美國MJ Reaserch公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及分組 24只大鼠購入后，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。隨機(jī)選取8只為正常對照組，余下16只大鼠按參考文獻(xiàn)〔5〕予以2.5%腺嘌呤懸浮液按250 mg·kg-1·d-1的劑量灌胃21 d，正常對照組用等量蒸餾水灌胃。采用目內(nèi)眥取血，測血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)，證實腺嘌呤誘導(dǎo)大鼠腎性腎衰竭(CRF)模型造模成功后，再隨機(jī)分為模型組、氯沙坦組，每組8只。

1.2.2 給藥方法 氯沙坦組按10 mg·kg-1·d-1給大鼠灌胃，用藥30 d，空白組、模型組予以等量蒸餾水灌胃。

1.2.3 標(biāo)本采集與取材 實驗結(jié)束時，各組大鼠予以戊巴比妥鈉麻醉處死，用電子秤稱體重后剖檢，取鮮活腎組織，觀察腎臟形態(tài)，稱重。腎組織縱切，一部分放入4%多聚甲醛溶液固定，另一部分放入凍存管置于-80℃冰箱保存。

1.2.4 生化指標(biāo)的檢測 留取血液、尿液送暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗中心，測定血清 Scr、BUN、24 h尿蛋白量(24 h MTP)等生化指標(biāo)。

1.2.5 腎組織病理學(xué)觀察 常規(guī)石蠟切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察。

1.2.6 Real Time PCR檢測 組織總RNA的提取按照Trizol說明書進(jìn)行。配置逆轉(zhuǎn)錄體系：5xPrimeScriptTMBuffer 2 μl，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5 μl，Oligo dT Primer 0.5 μl，Random 6 mers 0.5 μl，RNase Free dH2O 4.5 μl，Total RNA 2 μl配置成10 μl的反應(yīng)體系。充分混勻后然后放入PCR儀，37℃，15 min;85℃，5 s進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR。根據(jù)基因庫設(shè)計引物序列如下：GAPDH：上游5'-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3'，下游：5'-CTG TGC CGT TGA ACT TGC-3'，產(chǎn)物大小 140 bp;ACE2：上游 5'-CAC CAA CAT TAC GGT GGT G-3'，下游：5'-GCC TTC AGT TGA CGC TTG-3'，產(chǎn)物大小 144 bp;TGF-β1：上游 5'-CAGGGCTTTCGCTTCAGT-3'，下游 5'-TGAGGAGCAGGAAGGGTC-3'，產(chǎn)物大小 139 bp。PCR 擴(kuò)增條件：95℃、5 min，95℃、5 s，GAPDH 60℃、30 s(ACE2 57℃、30 s;TGF-β1 58℃、30 s)，72 ℃、15 s，40 個循環(huán)。以RNase Free dH2O代替cDNA為陰性對照組。采用2-△△CT法計算組間倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)資料以s表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 氯沙坦對腎間質(zhì)纖維化大鼠Scr、BUN、24 h MTP、腎臟指數(shù)的影響 模型組大鼠的Scr、BUN和24 h MTP與正常組比較明顯升高(P＜0.01)，說明模型復(fù)制成功。氯沙坦組大鼠與模型組比較各指標(biāo)有好轉(zhuǎn)，Scr、BUN和24 h MTP水平顯著下降(P＜0.01)。模型組大鼠與正常組比較，腎臟指數(shù)明顯升高(P＜0.01)，證實模型大鼠腎臟明顯腫大;氯沙坦組與模型組比較腎臟指數(shù)明顯下降(P＜0.05)。說明氯沙坦具有保護(hù)腎功能的作用。見表1。

表1 各組Scr、BUN、24 h MTP、腎臟指數(shù)比較( s，n=8)

表1 各組Scr、BUN、24 h MTP、腎臟指數(shù)比較( s，n=8)

與正常組比較：1)P ＜0.01;與模型組比較：2)P ＜0.05，3)P ＜0.01

組別 Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)24 hMTP(mg/d)腎臟指數(shù)(‰)正常組 19.38±1.41 4.06±1.48 181.25±56.63 4.86±0.26模型組 110.50±19.871)19.76±5.721)1015.10±207.601)14.18±3.401)氯沙坦組 38.13±7.733) 11.82±2.453)444.25±84.593)11.38±2.252)

2.2 氯沙坦對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎臟病理變化的影響 肉眼觀察腎組織，正常組腎臟呈蠶豆樣，形態(tài)規(guī)整，顏色為紅褐色，質(zhì)地堅實，體積正常無腫大，有光澤。模型組和氯沙坦組大鼠的腎臟體積均呈現(xiàn)不同程度增大，尤其模型組腎臟增大最為明顯，呈“大白腎”外觀，腎臟表面可見大量白色顆粒密集分布，質(zhì)地堅實。

HE染色光鏡下觀察：正常組大鼠的腎小球、腎小管、腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常。模型組可見大量的腎小管上皮細(xì)胞凋亡、壞死、脫落或空泡樣變性，腎小管高度擴(kuò)張，有不同程度的萎縮、硬化甚至壞死，被纖維組織代替;腎小管內(nèi)、腎間質(zhì)內(nèi)有大量金黃色的嘌呤代謝產(chǎn)物結(jié)晶沉積。氯沙坦組也可見小管擴(kuò)張、萎縮，間質(zhì)纖維化，腎間質(zhì)內(nèi)有少量金黃色的嘌呤代謝產(chǎn)物結(jié)晶，伴有淋巴細(xì)胞浸潤，但纖維化程度輕于模型組。見圖1。

2.3 氯沙坦對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織ACE2 mRNA表達(dá)的影響 模型組大鼠腎組織ACE2 mRNA表達(dá)水平與正常組比較顯著減少(P＜0.01)，僅為正常組的0.20倍。經(jīng)治療后，氯沙坦組ACE2 mRNA表達(dá)水平顯著增加(P＜0.01)，較模型組上升了2.34倍。見表2。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理改變(HE，×100)

表2 各組ACE2 mRNA表達(dá)水平比較( s，n=8)

表2 各組ACE2 mRNA表達(dá)水平比較( s，n=8)

與正常組比較：1)P＜0.01;與模型組比較：2)P＜0.05;下表同

組別 CTAvg.ACE2 CTAvg.GAPDH △CT 2-△△CT 26.65±1.79 21.22±0.78 5.28±1.07 -模型組 26.00±0.57 18.63±0.70 7.38±0.58 0.26±0.131)氯沙坦組 27.34±1.35 20.79±0.46 6.55±1.27 2.34±1.392)正常組

2.4 氯沙坦對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織TGF-β1 mRNA的影響 模型組TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平較正常組上升了5.92倍(P＜0.01)。經(jīng)治療后，氯沙坦組TGF-β1 mRNA表達(dá)水平較模型組顯著減少(P＜0.01)，減少幅度達(dá)到43%。見表3。

表3 各組TGF-β1 mRNA表達(dá)水平比較( s，n=8)

表3 各組TGF-β1 mRNA表達(dá)水平比較( s，n=8)

組別 CTAvg.TGF-β1 CTAvg.GAPDH △CT 2-△△CT 27.97±0.34 21.08±1.04 6.89±0.77 -模型組 23.80±0.70 19.41±1.23 4.39±0.59 5.92±1.861)氯沙坦組 27.07±0.74 21.50±0.79 5.43±0.66 0.57±0.292)正常組

3 討論

近來的流行病學(xué)調(diào)查表明，CKD的患病率、病死率都在逐年上升，在老年群體中患病率更高。在美國，成人CKD患者數(shù)已經(jīng)達(dá)2 600萬，其中65歲以上的老年CKD患者占CKD住院總?cè)藬?shù)的61.4%，每年因尿毒癥死亡者約為8.5萬〔6，7〕。我國CKD患病率約為10%，其中北京地區(qū)40歲以上人群CKD患病率約為18%，每年因尿毒癥死亡者約為45萬〔8〕。因此，CKD成為影響老年群體健康的主要疾病之一。

腎間質(zhì)纖維化是CKD的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，阻抑腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展對防治CKD意義重大。AngⅡ的受體主要有AT1和AT2，在腎臟組織中主要為AT1受體，通過與AT1受體結(jié)合而導(dǎo)致尿蛋白的產(chǎn)生;增加細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成，并減少ECM的降解，致ECM堆積;刺激細(xì)胞增殖，凋亡;增加炎癥細(xì)胞的浸潤，多方面共同促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展〔9〕。AngⅡ可以通過蛋白激酶(ERK)、C-Jun N端激酶(JUK)信號途徑上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，TGF-β1是強(qiáng)烈的促纖維化因子，參與了腎小管間質(zhì)病變及纖維化進(jìn)展的各個環(huán)節(jié)，活化TGF-β1可使細(xì)胞活性增強(qiáng)、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成增多，并抑制基質(zhì)的降解，促進(jìn)了纖維化的形成。AngⅡ還可上調(diào)TGF-β1受體的表達(dá)，增強(qiáng)TGF-β1 作用的敏感性〔10〕。

ACE2是最近研究發(fā)現(xiàn)的一種與人類ACE同源的羧肽酶〔11，12〕，它的生理功能是可以直接水解 AngⅡ為 Ang(1-7)，同時ACE2可以水解AngⅠ為Ang(1-9)，后者隨后被ACE降解為Ang(1-7);而且 ACE2催化 AngⅡ的活性是 AngⅠ的400倍〔13〕。Ang(1-7)具體有拮抗 AngⅡ的生理作用〔14〕，可能是由AngⅠ(1-7)誘導(dǎo)AT1受體下調(diào)引起的〔15〕。而ACE2的生理作用可以減弱ACE/AngⅡ/AT1的作用，同時增強(qiáng)ACE2/Ang(1-7)/Mas的作用，而發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化的作用。因此，ACE2更適合作為治療腎間質(zhì)纖維化的作用靶點(diǎn)。

TGF-β1是目前認(rèn)為的致腎間質(zhì)纖維化的重要因子。TGF-β1可刺激成纖維細(xì)胞增生，啟動腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)，增加ECM蛋白的合成，包括蛋白多糖膠原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ及纖維連接蛋白(FN)、層黏連蛋白(LN);減少基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)及增加組織金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)的合成，增加促纖溶酶原激活物抑制物(PAI)的表達(dá)，減少ECM的降解;增強(qiáng)細(xì)胞表面的ECM受體-整合素的表達(dá)，使細(xì)胞與基質(zhì)黏附增強(qiáng)，多方面共同促使ECM沉積，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。

氯沙坦劑量依賴性地增加兩腎一夾高血壓大鼠ACE2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，可劑量依賴性地顯著降低血壓，減少大鼠主動脈管壁厚度〔16〕。本實驗提示氯沙坦抗腎間質(zhì)纖維化的作用，不僅通過競爭性的結(jié)合AT1R，減弱了AngⅡ的生理作用，而且通過上調(diào)ACE2 mRNA表達(dá)抑制TGF-β1 mRNA的表達(dá)，起到抗腎間質(zhì)纖維化的作用。對于氯沙坦上調(diào)ACE2 mRNA的作用機(jī)制仍不清楚。目前合理的假說是由于氯沙坦負(fù)反饋引起了AngⅡ增加，由于Ang受體拮抗劑(ARB)減少了AngⅡ與其主要受體AT1R的結(jié)合，引起血漿和局部游離AngⅡ含量升高，為ACE2提供了更多的底物，可通過反饋途徑增加ACE2的表達(dá)。同時ARB也增加機(jī)體中Ang(1-7)的含量，并認(rèn)為增加Ang(1-7)的ARB部分治療效應(yīng)的實施者。

本實驗說明氯沙坦除了拮抗AT1R之外，同時上調(diào)ACE2的表達(dá)，可能直接水解AngⅡ，生成 Ang(1-7)，而對RAS起到了一個整體的調(diào)節(jié)。隨著對RAS中新成員的認(rèn)識，氯沙坦對RAS整體影響的作用機(jī)制，仍有待進(jìn)一步研究。

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