李寶善 馬厚勛 王艷嬌 吳 平 (重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院老年病科，重慶 400016)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是指缺血的心肌在成功恢復心臟血供的同時，血液循環(huán)中白細胞附壁、聚積，滲出血管而浸潤心肌，導致心肌細胞壞死，加之補體激活以及活性氧的產(chǎn)生，致使心肌損傷更為嚴重，出現(xiàn)心肌舒縮功能降低、再灌注心律失常、梗死面積擴大等現(xiàn)象。隨著經(jīng)皮冠狀動脈腔內成形術、冠脈內支架置入術等新療法的廣泛應用，MIRI越來越常見，并在缺血性心臟病病程中扮演了重要的角色，被認為是心肌保護問題的關鍵〔1〕。為此我們利用基因轉染技術將Klotho基因轉染至H9c2(2-1)大鼠心肌細胞，探討轉染Klotho基因對大鼠心肌細胞MIRI的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 質粒載體pAAV-MCS為Stratagene公司產(chǎn)品。RNAiso Plus、各種限制性內切酶、PrimeScript?RT reagent Kit、Premix Taq?Version2.0(Loading dye mix)、DNA Marker、T4 DNA連接酶為TakaRa公司產(chǎn)品，膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Omega公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成。DMEM高糖培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品。Fermentas轉染試劑為美國MBI公司產(chǎn)品。H9c2(2-1)大鼠心肌細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。胎牛血清購自Hyclone公司。兔抗人、鼠Klotho抗體購自Abcam公司，F(xiàn)ITC標記山羊抗兔IgG為博奧森公司產(chǎn)品。LDH與MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。昆明小鼠購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。免疫染色固定液、封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、抗淬滅封片液均為碧云天公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 Nano Drop2000微量分光光度計(Thermo)，s1000 PCR儀、DNA電泳凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)，Leica DM6000B熒光顯微鏡，HEPA Class100 3131型三氣恒溫細胞培養(yǎng)箱(Thermo)，SpectraMax M2e酶標儀(Molecular Devices)。

1.2 重組pAAV/Klotho質粒構建 參考趙景宏等〔2〕研究方法改進。

1.4 重組pAAV/Klotho質粒的構建 將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定片段大小，膠回收3 kb左右條帶。EcoR I/Xho I分別對腺相關病毒空載體pAAV-MCS進行雙酶切，膠回收目的片段，然后將酶切后載體與之前酶切回收cDNA片段按1∶10(摩爾數(shù)比)進行連接，連接產(chǎn)物轉化TOP10感受態(tài)細胞，轉化后細胞涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。

1.5 重組pAAV/Klotho質粒的篩選與鑒定 經(jīng)含氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落于37℃振蕩培養(yǎng)過夜后提取質粒，通過EcoR I/Xho I酶切對陽性重組質粒pAAV/Klotho進行鑒定。最終將鑒定陽性重組質粒送上海生工生物工程公司進行DNA測序，測序結果與GenBank中所報道目的基因序列進行比對和分析。

1.6 H9c2(2-1)細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基，25 cm2羅口培養(yǎng)瓶，5%CO2孵箱培養(yǎng)。

1.7 H9c2(2-1)細胞缺血再灌注模型復制 用以高純N2飽和、缺氧(1%O2)、無糖、缺鈣的 D-hank液模擬缺血溶液，待H9c2(2-1)細胞生長至鋪滿80%時置換正常培養(yǎng)液，放人缺氧培養(yǎng)箱中4 h模擬缺血，再以含20%血清的正常培養(yǎng)液置換缺血溶液，開放培養(yǎng)于正常培養(yǎng)箱中12 h模擬再灌注〔3〕。

1.8 基因轉染 參照Fermentas轉染試劑說明進行。

1.9 實驗分組 A.對照組(Control)：不轉基因，常氧培養(yǎng)64 h;B.模擬I/R組(I/R組)：不轉基因，常氧培養(yǎng)48 h后模擬I/R;C.轉染Klotho基因組(Klotho組)：以Fermentas轉染試劑為載體轉染Klotho基因，常氧培養(yǎng)48 h后模擬I/R;D.轉染空載體組(Vehicle control組)：不轉基因，空載體，常氧培養(yǎng)48 h后模擬I/R;每組重復5次。

1.10 心肌細胞Klotho mRNA水平檢測 各實驗組細胞按RNAiso Plus說明書提取總RNA，溶于 DEPC處理水。Nano Drop2000微量分光光度計測濃度在 0.5 μg/μl以上，A260/A280在1.9左右。按 PrimeScript?RT reagent Kit說明，10 μl體系加1 μg總RNA逆轉錄。以逆轉錄所得cDNA為模板，用Premix Taq?Version2.0(Loading dye mix)PCR擴增，所用上、下游PCR引物序列分別為5'GGGTCACTGGGTCAATCT3'和5'GCAAAGTAGCCACAAAGG3'(NCBI Reference Sequence：NM_013823.2)，PCR產(chǎn)物長度為710 bp。內參同前。

1.11 Klotho蛋白表達檢測(免疫熒光法)待各實驗組培養(yǎng)細胞爬片，融合60%左右時固定20 min、PBS洗4遍，封閉60 min，結合一抗(1∶37.5)4℃過夜。PBS洗 4遍，1∶75二抗37℃孵育1 h，抗淬滅封片液封片，Leica正置熒光顯微鏡觀察并采圖。

1.12 ELISA檢測各實驗組細胞培養(yǎng)的上清液Klotho蛋白水平 按ELISA試劑盒說明書操作。

1.13 細胞損傷指標的檢測 ①MTT比色法檢測細胞活性：細胞培養(yǎng)液中加入MTT溶液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，加DMSO，輕搖10 min，測各孔吸光度值(OD值)。以對照組OD值均數(shù)為對比計算細胞活性：細胞活性=各孔OD值/對照組OD值均數(shù)。②LDH活性檢測：按試劑盒說明進行操作，酶標儀檢測吸光度值。③丙二醛(MDA)含量：操作方法參照試劑盒說明書，721紫外分光光度儀檢測吸光度值。

2 結果

2.1 pAAV/Klotho質粒構建 以昆明小鼠腎臟總RNA為模板，通過RT-PCR技術克隆Klotho cDNA全長，EcoR I/Xho I雙酶切，連接載體pAAV-MCS。經(jīng)含氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落于37℃振蕩培養(yǎng)過夜后提取質粒，通過EcoR I/Xho I酶切對陽性重組質粒pAAV/Klotho進行鑒定。陽性重組質粒EcoR I/Xho I雙酶切后可見約4.7 kb載體片段和約3 kb Klotho cDNA片段(見圖1)。將酶切鑒定陽性重組質粒送上海生工生物工程公司進行DNA測序，測序結果與GenBank中所報道目的基因序列完全一致。

2.2 RT-PCR檢測各組Klotho mRNA表達情況 結果發(fā)現(xiàn)各實驗組均有Klotho mRNA表達，但Klotho轉染組Klotho mRNA表達水平明顯高于其他組，其余各組間無顯著性差異。說明Fermentas轉染試劑為載體轉染小鼠Klotho cDNA成功，有效使心肌細胞Klotho mRNA表達顯著上調(如圖2)。

圖1 pAAV/Klotho載體酶切鑒定

2.3 免疫熒光法檢測各組Klotho蛋白表達情況 免疫熒光法檢測結果顯示各組細胞膜及胞漿中 Klotho蛋白表達，其中Klotho轉染組熒光表達較其他細胞組多，熒光強度更強，說明轉染成功，結果滿意。

2.4 各組細胞活性、LDH、MDA、Klotho蛋白含量檢測結果 I/R后，細胞活性較正常對照組低，反映細胞損傷的指標LDH、MDA明顯較正常對照組高(P＜0.01)。在I/R的三組中，Klotho轉染組(C組)其細胞活性高于I/R對照組(B組)和空載體轉染組(D組);而其反映細胞損傷的指標LDH、MDA明顯低于I/R對照組(B組)和空載體轉染組(D組)(P＜0.01)。細胞培養(yǎng)上清液中檢測到的Klotho蛋白主要為分泌型Klotho蛋白，Klotho轉染組的細胞培養(yǎng)上清液中分泌型Klotho蛋白含量明顯高于其他三組(P＜0.01)。見表1。

圖2 RT-PCR結果

圖3 Klotho蛋白免疫熒光圖

表1 各組細胞活性、LDH、MDA、Klotho蛋白含量檢測結果( s，n=5)

表1 各組細胞活性、LDH、MDA、Klotho蛋白含量檢測結果( s，n=5)

與A組相比：1)P＜0.01;與B組相比：2)P＜0.01;與D組相比：3)P＜0.01

組別 細胞活性(%)上清液LDH含量(U/L)上清液MDA含量(nmol/L)上清液Klotho蛋白含量(U/L)A 100±0 83.75±1.70 1.59±0.07 49.70±4.44 B 68.14±7.401) 218.45±2.791) 2.95±0.151) 45.63±0.811)C 81.32±9.931)2)3)122.15±6.461)2)3)0.53±0.081)2)3)76.85±10.881)2)3)D 69.54±9.211) 206.84±21.761) 2.66±0.351) 45.23±1.651)

3 討論

Klotho基因是1997年由Kuro等〔4〕首先從衰老表現(xiàn)的模型小鼠中克隆成功，并以古希臘神話紡織生命之線女神的名字-Klotho來命名。研究發(fā)現(xiàn)該基因表達缺陷的小鼠會出現(xiàn)類似人衰老的一系列表型變化，動脈硬化和異位鈣化、糖和能量代謝異常生殖器官萎縮、骨質疏松、肺氣腫等。Klotho基因全長50 kb，包含5個外顯子，4個內含子，在人類Klotgo基因定位于第13號染色體(13q12)，其可通過選擇性拼接產(chǎn)生兩種蛋白產(chǎn)物(Klotho)：一種為膜型Klotho蛋白，屬于一種單次跨膜蛋白，其全長為1 012個氨基酸，主要在腎臟的遠曲小管細胞及腦脈絡叢等表達，其作為成纖維細胞生長因子23(fibroblasts growth factor 23，F(xiàn)GF23)專一性復合受體的主要成分而發(fā)揮其重要生理調節(jié)作用;另一種為分泌型Klotho蛋白，該類型缺乏跨膜結構和胞內結構區(qū)，全長為549個氨基酸，在小鼠血液、尿液及腦脊液中均能被檢測到。

跨模型Klotho蛋白通過與Na+-K+ATP酶α1亞基結合，增加該亞基在細胞表面數(shù)量來實現(xiàn)其對細胞外鈣濃度降低的應答反應〔5〕，具有調節(jié)離子通道活性;分泌型Klotho作為一種循環(huán)因子或激素，抑制細胞內胰島素/胰島素樣生長因子-1(insulin/IGF-1)信號級聯(lián)放大效應〔6〕，可抑制胰島素/IGF-1信號通路;還可以抑制氧化應激以及Wnt信號轉導〔7，8〕，并具有調節(jié)一氧化氮合成的作用。

本研究結果證明Klotho蛋白對H9c2(2-1)大鼠心肌細胞缺血再灌注具有很好的保護作用。本實驗證實了Klotho的抗氧化應激作用，由此推測Klotho對H9C2(2-1)大鼠心肌細胞缺血再灌注的保護作用機制可能與抗氧化應激有關，是否還與Klotho調節(jié)心肌細胞膜離子通道活性、抑制胰島素/IGF-1信號通路、抑制Wnt信號轉導以及一氧化氮合成等作用有關，還有待證實。

目前基因治療所用的基因載體主要有病毒和非病毒兩類。非病毒載體脂質體具有下列優(yōu)點：①易于制備，使用方便，可攜帶大的DNA片斷;②毒性、免疫原性低;③可防止攜帶DNA被體內物質降解，可將其特異性傳遞到靶細胞中;④離體細胞可以瞬間表達外源基因〔9～11〕。本實驗中使用的脂質體是新一代產(chǎn)品——Fermentas轉染試劑，用其轉染不受血清的干擾，轉染操作更為方便。實驗結果表明該Fermentas轉染試劑介導的外源基因得到了有效表達。

總之，通過Fermentas轉染試劑可以穩(wěn)定地把Klotho基因轉入H9c2(2-1)細胞，轉染Klotho基因則可減輕H9c2(2-1)細胞模擬I-R損傷，對H9c2(2-1)細胞具有保護作用;同時本研究為探討Klotho基因對缺血性心臟病的治療作用、提高其安全性提供了可行的實驗依據(jù)。

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