呂小榮 鐘 遠 (上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院老年科，上海 200233)

攜帶ApoEε4基因在不同地域不同人群中均可增加阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病風險〔1〕，并且使AD的發(fā)病年齡提前，但是攜帶ε2基因?qū)D是否有保護作用還存在爭議。輕度認知障礙(MCI)是介于老年人正常認知狀態(tài)與癡呆之間的一種認知受損狀態(tài)，每年有 16% ～17.2% 的 MCI病人進展為 AD〔2，3〕。ε4基因作為AD的危險因素，亦能增加MCI的發(fā)病風險，同時促進MCI認知功能惡化〔3〕。由于MCI患者的異質(zhì)性，種族及環(huán)境因素的差異可能會影響研究結(jié)果。本研究同時比較ApoE基因多態(tài)性與MCI和AD的關(guān)系，分析ApoE在認知功能退化的各個階段的影響，以期綜合評價在中國人群中ApoE基因多態(tài)性與MCI和AD發(fā)病的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 對象 來自2007～2010年上海市第六人民醫(yī)院老年科專家門診及住院部患者。AD組：采用美國國立精神病學、語言障礙和卒中-老年性癡呆和相關(guān)疾病學會(NINCDS-ADRDA)制定的“很有可能AD”診斷標準。所有患者無陽性家族史，并排除嚴重腦血管疾病、精神分裂癥、抑郁癥、癲癇、昏迷。AD組共100例，男56例，女44例;年齡66～89歲，平均(77.0±4.8)歲;簡易智能狀態(tài)檢查(MMSE)得分(16.9±5.8)。文盲和小學30例，中學39例，大學或更高31例。MCI組：入組標準參照1999年P(guān)eterson等提出的MCI診斷標準：①有記憶力減退主訴，且病程超過6個月;②沒有或很少伴有其他認知域損害;③臨床癡呆量表(CDR)評分為0.5;④MMSE評分24～27分;⑤日常生活活動量表(ADL)評分＜26分;⑥非癡呆。排除標準同AD組。MCI組共84例，男49例，女35例;年齡69～92歲，平均年齡(81.7±4.8)歲;MMSE得分(24.4±2.6)。文盲和小學7例，中學23例，大學或更高53例。正常對照組：均符合以下入組標準：①無記憶力減退主訴;②日常生活能力正常;③CDR=0分;④MMSE評分＞27分;⑤年齡、性別與MCI組、AD組相匹配。排除標準同AD組。其中男性60例，女性46例，平均年齡(79.5±5.0)歲，MMSE得分(28.7±1.4)。文盲和小學1例，中學12例，大學或更高88例。

1.2 DNA抽提 按常規(guī)方法提取外周血白細胞基因組DNA，純度達到1.8＜A280/A260＜1.9。

1.3 PCR擴增目的基因片段 引物設(shè)計參考文獻〔4〕，上游引物為5'-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3'，下游引物為5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGFACAC-3'。PCR反應(yīng)體系為20 μl，含有 DNA 模板 200 ～ 300 ng，Taq 酶 1 U，DMSO 1 μl，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物 0.2 μmol/L，Mg2+1.5 mmol/L。反應(yīng)條件：95℃變性 5 min，95℃變性 30 s，63℃退火 30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)35次，72℃延伸10 min。用2%的瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物。

1.4 限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析 取5 μl PCR產(chǎn)物，加 2 U HhaI內(nèi)切酶，2 μl 10 × buffer，用水補足至20 μl，37℃酶切過夜。取5 μl酶切產(chǎn)物，采用12%非變性聚丙烯酰胺膠電泳，電壓150 V，電泳4 h。電泳結(jié)束后銀染，用超純水漂洗1 min，加銀染液0.1%AgNO3，置水平搖床10 min，純水漂洗1 min，加顯影液(1.2%NaOH，4%甲醛)顯影，條帶清晰時用乙酸終止反應(yīng)。拍片，根據(jù)電泳條帶確定基因型。

1.5 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 17.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗進行Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗，基因頻率和基因型的分布差異亦采用χ2檢驗分析。各組計量資料采用單因素方差分析進行分析。采用Logistic回歸校正年齡、性別等因素的影響，計算比值比(OR)及其95%CI。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗 除AD組外，正常對照組和MCI組ApoE基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＜0.05)。

2.2 各組ApoE基因型及等位基因頻率 各組中ε3/ε3為最常見基因型，ε3為頻率最高等位基因，ε4次之，ε2最少。ε4基因頻率在正常對照組、MCI組和AD組中逐漸遞增。ε2基因在各組中的分布相似。組間比較基因型顯示MCI組與正常對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，AD組與MCI組、正常對照組差異均顯著(P＜0.05);三組基因型總體比較統(tǒng)計學差異顯著(P＜0.01)。等位基因組間兩兩比較差異均顯著(P＜0.05)，總體比較差異非常顯著(P＜0.01)。見表1。

表1 各組別ApoE基因型及等位基因分布〔n(%)〕

將基因型分為 ε2(+)基因型(包括 ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4)與 ε2(-)基因型(包括 ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4)，三組總體比較其差異無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，各組兩兩比較發(fā)現(xiàn)均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。將基因型分為 ε4(+)基因型(包括 ε4/ε4、ε2/ε4、ε3/ε4)與 ε4(-)基因型(包括 ε2/ε2、ε2/ε3、ε3/ε3)，三組總體比較有顯著性差異(P＜0.01)，各組兩兩比較其差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。ε4(+)基因型的頻率在正常對照組、MCI組、AD組中逐漸升高。

2.3 ApoE基因多態(tài)性對MCI和AD發(fā)病風險影響 采用Logistic回歸校正年齡、性別，分析表明ε4基因攜帶者患MCI的風險為非攜帶者的2.7倍(OR=2.7，95%CI=1.29～5.70)，患AD的風險為非攜帶者的3.7倍(OR=3.7，95%CI=1.89～7.38)。見表2。

表2 ApoEε4比值比

3 討論

目前ApoEε4基因是最重要的散發(fā)性AD易感基因，鑒于MCI向AD的高轉(zhuǎn)化率，ε4基因可能與MCI密切相關(guān)。在本研究中中國漢族人群ε4基因頻率為7.5%，與國內(nèi)其他研究結(jié)果類似〔5，6〕，低于高加索人群的基因頻率 14%〔7〕，這可能是中國人群中AD發(fā)病率低于國外的原因。

本研究的結(jié)果表明ε4基因是MCI和AD共同的危險因素，這與其他AD或 MCI的研究報道想一致〔5，6〕。ApoE在腦中主要由星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生，以膽固醇和脂質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)運的方式調(diào)節(jié)突出的重塑及細胞間的物質(zhì)交換，并且ApoE對Aβ的聚集和清除有調(diào)節(jié)作用〔8〕。ApoE不同亞型對腦中脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)存在差異，這可能是ε4基因增加MCI與AD發(fā)病風險的機制。

同時本研究中ε4基因?qū)CI和AD發(fā)病的影響存在差異，可能有以下原因。在臨床隨訪中，MCI患者除了進展為AD外，部分病人的認知功能不再繼續(xù)惡化甚至恢復(fù)〔9，10〕。在對MCI患者尸體解剖中發(fā)現(xiàn)部分MCI患者神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)為AD的病理變化，其他MCI患者則表現(xiàn)為輕微血管損傷、海馬硬化和嗜銀顆粒〔11〕。因此MCI作為一種綜合征，雖與AD密切相關(guān)，但臨床預(yù)后與病理學變化較AD更具多樣性。Farlow等〔12〕對494例MCI患者的研究發(fā)現(xiàn)，ε4基因攜帶者海馬區(qū)體積更小，認知功能更差，病理變化與AD更相似。亦有研究證明MCI患者中ε4攜帶者轉(zhuǎn)化為AD的概率更高〔13〕。以上證據(jù)可說明ε4基因促使MCI患者進展為AD，并導致MCI向AD的高轉(zhuǎn)化率。因此MCI可能并非AD的獨立危險因素，兩者的遺傳學差異有待進一步的研究。

在各種研究報道中ε2基因?qū)D的作用并不一致，本研究中ε2基因?qū)D無保護作用，與臺灣的Lung等〔14〕研究相一致，而Wilson等〔15，16〕研究報道 ε2基因具有保護作用。分析上述結(jié)果的差異可能與種族有關(guān)，樣本的選擇可能也是一個重要因素。綜上所述在中國人群中認知功能障礙的各個階段，ε2基因均無保護作用。

總之，ε2基因?qū)CI和AD的發(fā)病風險無保護作用，ε4基因雖然是MCI和AD共同的危險因素，但對MCI和AD影響存在差異。ApoE基因多態(tài)性引起的脂代謝差異與MCI和AD神經(jīng)系統(tǒng)的病理學變化之間的關(guān)系需要進一步的研究。

1 Bennett DA，Wilson RS，Schneider JA，et al.Apolipoprotein E epsilon4 allele，AD pathology，and the clinical expression of Alzheimer's disease〔J〕.Neurology，2003;60(2)：246-52.

2 Petersen RC，Thomas RG，Grundman M，et al.Vitamin E and donepezil for the treatment of mild cognitive impairment〔J〕.N Engl J Med，2005;352(23)：2379-88.

3 Landau SM，Harvey D，Madison CM，et al.Comparing predictors of conversion and decline in mild cognitive impairment〔J〕.Neurology，2010;75(3)：230-8.

4 Hixson JE，Vernier DT.Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HhaI〔J〕.J Lipid Res，1990;31(3)：545-8.

5 葉 妮，張臨洪.載脂蛋白E基因多態(tài)性與輕度認知障礙的關(guān)系〔J〕. 中華現(xiàn)代內(nèi)科學雜志，2006;3(1)：4-6.

6 Borenstein AR，Mortimer JA，Ding D，et al.Effects of apolipoprotein E-epsilon4 and-epsilon2 in amnestic mild cognitive impairment and dementia in Shanghai：SCOBHI-P〔J〕.Am J Alzheimers Dis Other Demen，2010;25(3)：233-8.

7 Farrer LA，Cupples LA，Haines JL，et al.Effects of age，sex，and ethnicity on the association between apolipoprotein E genotype and Alzheimer disease.A meta-analysis.APOE and Alzheimer Disease Meta Analysis Consortium〔J〕.JAMA，1997;278(16)：1349-56.

8 Kim J，Basak JM，Holtzman DM.The role of apolipoprotein E in Alzheimer's disease〔J〕.Neuron，2009;63(3)：287-303.

9 Bennett DA，Wilson RS，Schneider JA，et al.Natural history of mild cognitive impairment in older persons〔J〕.Neurology，2002;59(2)：198-205.

10 Ganguli M，Dodge HH，Shen C，et al.Mild cognitive impairment，amnestic type：an epidemiologic study〔J〕.Neurology，2004;63(1)：115-21.

11 Jicha GA，Parisi JE，Dickson DW，et al.Neuropathologic outcome of mild cognitive impairment following progression to clinical dementia〔J〕.Arch Neurol，2006;63(5)：674-81.

12 Farlow MR，He Y，Tekin S，et al.Impact of APOE in mild cognitive impairment〔J〕.Neurology，2004;63(10)：1898-901.

13 Okello A，Koivunen J，Edison P，et al.Conversion of amyloid positive and negative MCI to AD over 3 years：an 11C-PIB PET study〔J〕.Neurology，2009;73(10)：754-60.

14 Lung FW，Yen YC，Chou LJ，et al.The allele interaction between apolipoprotein epsilon2 and epsilon4 in Taiwanese Alzheimer's disease patients〔J〕.Acta Psychiatr Scand，2005;111(1)：38-43.

15 Wilson RS，Bienias JL，Berry-Kravis E，et al.The apolipoprotein E epsilon 2 allele and decline in episodic memory〔J〕.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2002;73(6)：672-7.

16 Caselli RJ，Dueck AC.APOE{varepsilon}2 and presymptomatic stage Alzheimer disease：How much is not enough〔J〕?Neurology，2010;75(22)：1976-81.