唐燕霞 肖 謙 薛艷艷 張棟珉 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年科內(nèi)分泌組，重慶 40006)

胰島素降解酶(IDE)作為降解β-淀粉樣蛋白(Aβ)的重要酶，是決定生物體體內(nèi)Aβ含量的關(guān)鍵因素之一，Aβ在腦內(nèi)的沉積可通過(guò)神經(jīng)毒性作用和誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡等機(jī)制損傷認(rèn)知功能〔1〕。研究報(bào)道，血管緊張素1-7〔Ang-(1-7)〕對(duì)學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能有重要影響〔2〕，但Ang-(1-7)對(duì)IDE的表達(dá)有無(wú)影響，目前還未見(jiàn)報(bào)道。本研究以糖尿病大鼠模型作為研究對(duì)象，用Ang-(1-7)及其受體拮抗劑A-779進(jìn)行干預(yù)，初步觀察Ang(1-7)對(duì)糖尿病大鼠海馬IDE的表達(dá)水平及認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 STZ(Sigma公司);Morris水迷宮及水迷宮記錄分析系統(tǒng)(中國(guó)醫(yī)科科學(xué)院藥物研究所研制);大鼠腦立體定位儀(Stoeling公司);Ang-(1-7)(Sigma公司);Mas受體拮抗劑A-779(Phoenix公司);RT-PCR試劑盒，DNA Marker DL2000(TaKaRa公司);羊抗大鼠IDE多克隆抗體(Santa公司);引物合成:南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及建模 SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，9～10周齡，體重180～200 g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(SCXK渝2007-0001)。動(dòng)物適應(yīng)喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)原則分為:對(duì)照組(C組)、糖尿病組(DM組)，糖尿病+Ang-(1-7)組〔DM+Ang-(1-7)組〕及糖尿病+Ang-(1-7)+A-779組〔DM+Ang-(1-7)+A-779組〕，每組各10只。建立STZ糖尿病模型，大鼠禁食12 h后，糖尿病組按60 mg/kg劑量一次性腹腔注射1%STZ，正常組注射等量生理鹽水。血糖穩(wěn)定3 d后，尾靜脈隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L視為建模成功標(biāo)準(zhǔn)。成模后第11周，各組均進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，之后行側(cè)腦室注射，持續(xù)1 w，所有實(shí)驗(yàn)大鼠再次進(jìn)行水迷宮測(cè)試。實(shí)驗(yàn)終末，糖尿病+Ang-(1-7)組死亡1只，糖尿病+Ang-(1-7)+A-779組大鼠死亡2只。

1.2.2 Morris水迷宮測(cè)試 糖尿病大鼠成模后第11周，行Morris水迷宮測(cè)試，記錄大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期，評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)能力和觀察120 s內(nèi)大鼠穿越平臺(tái)位置的次數(shù)，評(píng)價(jià)記憶能力，經(jīng)水迷宮圖像自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)對(duì)各參數(shù)進(jìn)行分析。Ang-(1-7)及A-779干預(yù)1 w后重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 側(cè)腦室注射 糖尿病大鼠建模成功后第11周，水迷宮測(cè)試完畢即行Ang-(1-7)及A-779干預(yù)。大鼠腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀下，沿顱頂正中線剪開(kāi)皮膚，剝離骨膜，暴露顱骨。大鼠側(cè)腦室穿刺定位:前囟后1.0 mm，右1.5 mm，深3.5 mm，微型電鉆沿此穿刺鉆孔，將帶內(nèi)芯的不銹鋼套管(外徑0.9 mm，內(nèi)徑0.5 mm)垂直插入側(cè)腦室內(nèi)，固定套管，縫合傷口，術(shù)后大鼠均給予青霉素抗炎。導(dǎo)管置入后第4天行側(cè)腦室注射。①對(duì)照組和糖尿病組注射等量生理鹽水;②糖尿病 +Ang-(1-7)組:微量注射器3 min內(nèi)將 Ang-(1-7)(5 nmol，1 μl)緩慢勻速注入側(cè)腦室，留針約1 min;③糖尿病+Ang-(1-7)+A-779組:微量注射器 3 min內(nèi)將 Ang-(1-7)(5 nmol，1 μl)和 A-779(50 nmol，1 μl)緩慢勻速注入側(cè)腦室，留針約1 min;各組每天給藥1次，持續(xù)7 d。

1.2.4 RT-PCR行為學(xué)測(cè)試后，大鼠斷頭，冰臺(tái)上快速取出海馬組織，液氮凍存，按照RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)提取海馬組織的總 RNA。逆轉(zhuǎn)錄體系為 20 μl，反應(yīng)條件:42℃ 10 min，30℃20 min，90℃ 5 min，冰浴5 min。PCR擴(kuò)增:IDE上游引物序列:5'-CGGGGCCAGGAAAGCAGTCTC-3'，下 游 引 物 序 列:5'-GCGATGCTCTGCTGGTTCAC-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度405 bp;GAPDH上游引物序列:5'-ACCCATCACCATCTTCCAGGAG-3'，下游引物序列:5'-GAAGGGGCGGAGATGATGAC-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度 159 bp。反應(yīng)體系:RT 產(chǎn)物 2.0 μl，上下游引物各1 μl，2 × Tap PCR master mix 10 μl，補(bǔ)充 DEPC 水至 20 μl。反應(yīng)條件:94℃ 5 min;94℃30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。取以上 PCR產(chǎn)物5 μl行瓊脂糖凝膠電泳，利用圖像分析系統(tǒng)對(duì)DNA條帶進(jìn)行激光度掃描，凝膠分析軟件進(jìn)行灰度分析，最后以目的基因與內(nèi)參的灰度比值來(lái)表示目的基因mRNA表達(dá)的相對(duì)含量。

1.2.5 Western印跡 稱取-80℃冰箱保存的海馬組織塊100 mg，加入0.2 ml RIPA和2 μl PMSF，超生細(xì)胞破碎儀低溫勻漿，離心后BCA法定量蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，免疫印跡，ECL顯影后條帶經(jīng)凝膠成像軟件分析，以 IDE與GAPDH條帶灰度比值表示IDE蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果 與對(duì)照組比較，DM組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P＜0.05)。與DM組比較，DM+Ang-(1-7)組逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P＜0.05)。與DM+Ang-(1-7)組比較，DM+Ang-(1-7)+A-779組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 RT-PCR結(jié)果 與對(duì)照組比較，DM組大鼠海馬IDE mRNA的表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05);與DM組比較，DM+Ang-(1-7)組IDE mRNA的表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)。與DM+Ang-(1-7)組比較，DM+Ang-(1-7)+A-779組 IDE mRNA的表達(dá)水平明顯減少(P＜0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

2.3 Western印跡結(jié)果 與對(duì)照組比較，DM組大鼠海馬IDE蛋白表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05);與DM組比較，DM+Ang-(1-7)組IDE蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)。與 DM+Ang-(1-7)組比較，DM+Ang-(1-7)+A-779組IDE蛋白表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)。見(jiàn)圖2，表2。

圖1 RT-PCR檢測(cè)各組大鼠海馬IDE mRNA表達(dá)

圖2 Western印跡檢測(cè)各組大鼠海馬IDE蛋白表達(dá)

表1 各組大鼠Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果(s)

表1 各組大鼠Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果(s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與DM組比較:2)P＜0.05;與DM+Ang-(1-7)組比較:3)P ＜0.05，下表同

組別 n 穿越平臺(tái)次數(shù) 逃避潛伏期(s)10 6.10±2.38 28.34±8.06 DM組 10 3.10±1.791) 54.43±9.771)DM+Ang-(1-7)組 9 5.89±1.452) 31.24±7.572)DM+Ang-(1-7)+A-779組 8 3.00±2.203) 55.93±7.943)對(duì)照組

表2 各組大鼠海馬IDE mRNA及蛋白表達(dá)水平(s)

表2 各組大鼠海馬IDE mRNA及蛋白表達(dá)水平(s)

IDE/GAPDH 10 0.65±0.09 0.56±0.08 DM組 10 0.40±0.081) 0.32±0.071)DM+Ang-(1-7)組 9 0.62±0.112) 0.52±0.102)DM+Ang-(1-7)+A-779組 8 0.38±0.063) 0.31±0.083)蛋白對(duì)照組組別 n IDE/GAPDH mRNA

3 討論

近年來(lái)的研究顯示，大腦腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)參與了學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)〔3～5〕，如:AngⅡ可以抑制海馬LTP效應(yīng)、抑制大腦神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放、激活氧化應(yīng)激以及減少中樞血流;AngⅣ可以促進(jìn)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)增多、易化海馬LTP效應(yīng)。Ang-(1-7)作為RAS中最重要的血管緊張素肽段，主要由ACE2分解AngⅡ而來(lái)，Ang-(1-7)及其功能性受體Mas在大鼠海馬、下丘腦和齒狀回顆粒細(xì)胞等都有豐富的表達(dá)〔6〕。Ang-(1-7)與Mas受體結(jié)合能夠舒張腦血管改善中樞血流、易化海馬LTP效應(yīng)、調(diào)節(jié)類膽堿突觸，表明其在學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能方面具有重要作用〔2，7〕。糖尿病大鼠認(rèn)知功能的受損程度與Aβ的表達(dá)呈正相關(guān)〔8〕，IDE作為Aβ的高效降解酶，參與了海馬Aβ的降解。本研究結(jié)果表明，Ang-(1-7)可以通過(guò)上調(diào)海馬IDE mRNA及蛋白的表達(dá)，改善糖尿病大鼠的認(rèn)知功能，推測(cè)其可能的途徑與IDE表達(dá)上調(diào)，海馬Aβ的降解增加，從而減輕Aβ的沉積有關(guān)。

1 Malaplate Armand C，F(xiàn)lorent Bechard S.Soluble oligomers of amyloid-β peptide induce neuronal apoptosis by activating a cPLA2-dependent sphingomyelinase-ceramide pathway〔J〕.Neurobiol Dis，2006;23(1):178-89.

2 Hellner K，Walther T，Schubert M，et al.Angiotensin-(1-7)enhances LTP in the hippocampus through the G protein-coupled receptor Mas〔J〕.Mol Cell Neurosci，2005;29:427-35.

3 張棟珉，肖 謙.腎素血管緊張素系統(tǒng)與糖尿病腦病〔J〕.國(guó)際內(nèi)分泌代謝雜志，2008;28(6):384-6.

4 張棟珉，肖 謙，李 娟.血管緊張素Ⅳ對(duì)糖尿病大鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)及認(rèn)知功能的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;30(9):1243-5.

5 Bonini JS，Bevilaqua LR，Zinn CG，et al.AngiotensinⅡdisrupts inhibitory avoidance memory retrieval〔J〕.Hormones Behav，2006;50:308-13.

6 Alenina N，Xu P，Rentzsch B，et al.Genetically altered animal models for Mas and angiotensin-(1-7)〔J〕.Exp Physiol，2007;93(5):528-37.

7 Evi Kostenis，Graeme Milligan，Arthur Christopoulos，et al.G-protein-coupled rece-ptor mas is a physiological antagonist of the angiotensinⅡtype 1 receptor〔J〕.Circulation，2005;111:1806-13.

8 蔡志友，晏 勇，張 駿.β-淀粉樣前體蛋白與β-淀粉樣蛋白在糖尿病大鼠腦組織中的表達(dá)意義及行為學(xué)相關(guān)性研究〔J〕.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008;37(5):644-7.