張 穎 紀 莉 張馨木 鮑 爽 王 贊 陳海燕 (吉林大學第一醫(yī)院，吉林 長春 3002)

傳統(tǒng)中醫(yī)認為人參的功能主治為益氣活血，通絡止痛，可以改善腦血液循環(huán)，改善神經(jīng)行為學，保護缺血腦組織，改善患者半身不遂或偏身麻木、口角偏斜、言語不利等癥狀，具有很好的臨床療效〔1〕;但其縮小梗死面積、腦保護的具體機制，尤其是腦保護的信號傳導機制尚不十分清楚。本研究擬建立老年小鼠大腦中動脈梗死 (MCAO)模型，觀察磷酸化胞外信號調(diào)節(jié)激酶 (p-erk1/2)、磷酸化c-Jun氨基末端蛋白激酶 (p-JNK2)、P-38蛋白表達的變化，進一步明確人參二醇組皂苷 (PDS)干預腦缺血后絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號傳導通路的變化。

1 材料與方法

1.1 對象 C57BL/6 18月齡老年小鼠分為4組:組Ⅰ，90 min MCAO組;組Ⅱ，PDS 5 mg/L小劑量組;組Ⅲ，PDS 25 mg/L中劑量組;組Ⅳ，PDS 50 mg/L大劑量組，每組10只。

1.2 方法

1.2.1 老年小鼠MCAO模型制備 采用1%Isoflorin氣體麻醉，應用恒溫儀使直腸溫度保持在37℃，分離結(jié)扎左側(cè)頸總動脈和頸外動脈，將帶有硅膠的8.0尼龍線從頸總動脈插入頸內(nèi)動脈，長度為9 mm，阻斷大腦中動脈血流，在90 min時將尼龍線撤出，進行再灌注。

1.2.2 激光多普勒血流儀(LDF)監(jiān)測 在實驗過程中用0.5 mm光纖探頭監(jiān)測腦血流，右側(cè)大腦中動脈區(qū)位置為囟門旁開6 mm、后2 mm。大腦中動脈梗死后24 h進行神經(jīng)功能缺損評分。

1.2.3 Western印跡分析 組織冰凍切片，應用裂解液裂解，取上清液用于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)，等量蛋白被溶于6×SDS緩沖液，煮沸，并載入15%多丙烯膠，蛋白被轉(zhuǎn)移到聚乙烯醇縮甲醛(PDF)膜上，浸在一抗多克隆羊抗p-erk1/2、p-JNK2、P-38中過夜干燥，膜再浸在驢抗羊或羊抗兔二抗中，洗脫后，浸在電化學發(fā)光(ECL)顯影液中顯影。采用IMAGE J軟件分析所得蛋白帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPPS統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)資料以s表示，組間差異采用單因素方差分析及配對t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 LDF監(jiān)測結(jié)果 老年小鼠術(shù)中均進行LDF監(jiān)測，線栓后LDF的血流值降低到15% ～20%，90 min進行大腦中動脈梗塞模型再灌注，血流恢復50%以上為梗塞再灌注模型成功，兩組組間LDF值無明顯差異(P＞0.05)。

2.2 各組神經(jīng)功能評分比較 各組神經(jīng)功能評分:組Ⅰ(2.3±0.5)分;組Ⅱ(2.1±0.9)分;組Ⅲ(1.7±0.7)分;組Ⅳ(1.5±0.6)分。其中，中、大劑量PDS組(組Ⅲ、Ⅳ)神經(jīng)功能評分與梗死組(組Ⅰ)比較明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);小劑量PDS組(組Ⅱ)神經(jīng)功能評分與梗死組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.3 Western印跡分析結(jié)果 PDS中、大劑量組MCAO老年小鼠腦p-erk1/2、p-JNK2蛋白表達升高(P＜0.05)，P-38蛋白表達無變化(P＞0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測各組老年小鼠β-actin、p-erk1/2、p-JNK2、P-38蛋白表達的變化

3 討論

缺血性腦梗死不僅可以導致部分腦的血液供應缺乏，而且導致缺血區(qū)的神經(jīng)凋亡和壞死〔2〕。MAPK信號通路能將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)導至細胞及其核內(nèi)，并引起細胞多種生物學反應，在細胞的生長、分化及凋亡過程中起著重要作用，并參與腦缺血損傷及神經(jīng)保護的過程。目前已發(fā)現(xiàn)多條并行的MAPK信號通路，erk1/2、JNK2、P-38均與細胞的生長及分化密切相關，其中erk1/2通路被認為是經(jīng)典的信號通路，在細胞的生長增殖和分化及凋亡過程中起重要作用。有研究表明，通過活化erk1/2，預處理或后處理活化下游抗凋亡分子，可減少腦損傷〔3〕。erk1/2 作為治療的新靶點日益受到關注〔4〕。Nagata等〔5〕發(fā)現(xiàn)JNK和P-38在凋亡中起重要作用。目前已經(jīng)分離鑒定了近40種人參皂苷，根據(jù)其苷元結(jié)構(gòu)可分為齊墩果酸型、原人參二醇型和原人參三醇型，其中原人參二醇型皂苷共有20余種，西洋參葉20(s-)原PDS由五加科人參屬植物西洋參葉總皂苷分離純化得到，主要含有人參皂苷 Rb3、Rd、Rb2和Rbl。本研究顯示，PDS 20(s)中、大劑量組老年小鼠腦p-ERK 1/2、p-JNK2蛋白表達升高，P-38蛋白表達無變化，說明 PDS干預MCAO老年小鼠腦早期改變可能與ERK、JNK2通路有關，而與P-38通路無關。MAPK家族成員具有不同的上游激活子和不同的底物，因而可能有不同的機制參與，ERK、JNK2激活后是否通過線粒體途徑參與凋亡的過程，尚有待于進一步研究。

1 Park Sl，Jang DK，Han YM，et al.Effect of combination therapy with sodium ozagrel and panax ginseng on transient cerebral ischemia model in rats〔J〕.J Biomed Biotechnol，2011;178:169-80.

2 Kilic U，Kilic E，Reiter RJ，et al.Signal transduction pathways involved in melatonin-induced neuroprotection after focal cerebral ischemia in mice〔J〕.J Pineal Res，2005;38(1):67-71.

3 Zhang L，Zhang ZG，Liu XS，et al.The PI3K/Akt pathway mediates the neuroprotective effect of atorvastatin in extending thrombolytic therapy after embolic stroke in the rat〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007;27:2470-5.

4 Breslin JW，Pappas PJ，Cerveira JJ，et al.VEGF increases endothelial permeability by separate signaling pathways involving ERK-1/2 and nitric oxide〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003;284(10):92-100.

5 Nagata Y，Takahashi N，Davis RJ，et al.Activation of p38 MAP kinase and JNK but not ERK is required for erythropoietin-induced erythroid differentiation〔J〕.Blood，1998;92(6):1859-69.