吳 哲 趙艷華 彭 博 羅曉光 羅小萌 (中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 000)

堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)可促進(jìn)大腦皮質(zhì)、海馬、小腦以及多巴胺能、骨髓和感覺神經(jīng)元存活〔1〕。FGF受體(FGFR)屬酪氨酸激酶受體家族中成員，介導(dǎo)FGF信號進(jìn)入細(xì)胞，由 bFGF/FGFR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括:PKC〔2〕、Ras-RafMEK-ERK〔3〕、JAK-STAT〔4〕和 PI3K 途徑〔5〕。有研究顯示，阿爾茨海默病(AD)患者大腦神經(jīng)元蛋白激酶C(PKC)表達(dá)異常減少和ERK1/2表達(dá)異常增加〔6〕。MAPK/ERK級聯(lián)激活是AD早期病生理學(xué)特征，可能參與神經(jīng)元退行性變的自我刺激過程，以及這些條件下的錯誤修復(fù)〔7〕。目前，尚無有關(guān)bFGF對AD模型細(xì)胞PKCγ和ERK1/2表達(dá)和活性影響的文獻(xiàn)報道，我們采用Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞建立AD細(xì)胞模型，以探討bFGF對AD模型細(xì)胞PKCγ及ERK1/2表達(dá)和活性的影響，可望為其臨床治療提供新的思路與途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 PC12細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。每3天換液1次，5～6 d傳代1次。

1.2 試 劑 與 藥 品 Aβ25～35，MTT，DMSO(Sigma 公 司)，PD98059(美國Promega公司)，一抗為兔抗鼠P-ERK1/2單克隆抗體和兔抗鼠PKCγ單克隆抗體(美國SANTA公司)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG HRP(北京中山生物技術(shù)有限公司，進(jìn)口分裝)，bFGF(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，硝酸纖維素膜(美國Millipore公司)，凝膠上樣緩沖液，十二烷基磺酸鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺、甲醇、顯影液、定影液、丙酮、二甲苯、無水乙醇、甲醛、脫脂奶粉(華美公司)，胎牛血清、馬血清、胰蛋白酶，PRMI-1640培養(yǎng)液(Gibco公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)及分組 置于PRMI-1640培養(yǎng)基，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱孵育，3 d換液1次，進(jìn)行分組。(1)正常對照組:取對數(shù)生長的PC12細(xì)胞培養(yǎng)48 h。(2)Aβ?lián)p傷組:取對數(shù)生長的PC12細(xì)胞加入終濃度為20 μmol/L的Aβ25～35培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。(3)bFGF組:取對數(shù)生長的PC12細(xì)胞加入含bFGF(終濃度分別為25、50、75和100 ng/L)及肝素(終濃度為80 ng/L)培養(yǎng)液，2 h后滴加 Aβ25～35(終濃度為20 μmol/L)培養(yǎng)48 h。(4)PD98059抑制劑組:取對數(shù)生長的PC12細(xì)胞加入含PD98059培養(yǎng)液終濃度分別為25、50、75和100 μmol/L，60 min 后滴加 bFGF(終濃度 50 ng/L)，培養(yǎng)至120 min滴加 Aβ25～35及肝素(終濃度 80 ng/L)，培養(yǎng) 48 h。

1.3.2 MTT法檢測PC12細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期PC12細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后制備單細(xì)胞懸液，以105個細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔滴加1640培養(yǎng)基200 μl，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)液、以無血清培養(yǎng)基沖洗兩次，分別于對照組、Aβ?lián)p傷組和bFGF組、空白對照(不加細(xì)胞)，每孔滴加 MTT 20 μl、37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，倒出培養(yǎng)液、加入DMSO 150 μl，振蕩搖勻、室溫靜置30 min，以空白對照組調(diào)零，酶標(biāo)儀于570 nm處讀取不同處理組細(xì)胞吸光值(OD值)，每組實驗設(shè)定3個復(fù)孔，取平均值。

1.3.3 Western印跡法檢測p-ERK1/2和PKCγ蛋白表達(dá) 不同處理組PC12細(xì)胞(約5×106)，置于預(yù)冷100 μl細(xì)胞裂解液、超聲粉碎，離心1 h后采集上清液，改良酚試劑法測量不同處理組蛋白水平。每組取總蛋白40 μg，于10%(W/V)聚丙烯酰胺凝膠溶液中進(jìn)行電泳1.5～2 h，電壓50 V轉(zhuǎn)印2 h后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上;TBST溶液清洗NC膜，置含5%(W/V)脫脂奶粉 TTBS溶液中、4℃封閉過夜;TTBS溶液清洗，加入p-ERK1/2和 PKCγ(I抗，1∶800)，室溫下孵育 2 h，TBS 液洗膜后加入山羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)，ECL試劑顯帶X線片曝光，顯影定影后掃描，電泳帶的灰度用Band Scan軟件分析，以β-actin灰度值之比作為半定量結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計分析方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計算與分析。實驗數(shù)據(jù)以s表示，不同樣本均數(shù)f剛的比較行單因素方差分析(ANOVA)和兩兩比較的q檢驗。使用相關(guān)分析分析藥物濃度與細(xì)胞存活率之間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組PC12細(xì)胞存活率 Aβ?lián)p傷組OD值及細(xì)胞存活率顯著低于與對照組(P=0.02)，而bFGF組OD值及細(xì)胞存活率則顯著高于Aβ?lián)p傷組(P=0.01)，Pearson相關(guān)分析顯示細(xì)胞存活率與bFGF藥物濃度呈正相關(guān)(r=0.08，P=0.01)。提示bFGF具有神經(jīng)元保護和拮抗Aβ毒性作用。見表1。

圖1 正常對照組和Aβ?lián)p傷組PC12細(xì)胞p-ERK1/2和PKCγ蛋白表達(dá)變化

圖2 bFGF組和Aβ?lián)p傷組PC12細(xì)胞p-ERK1/2和PKCγ蛋白表達(dá)變化

表1 不同處理組PC12細(xì)胞OD值及細(xì)胞存活率的比較(s)

表1 不同處理組PC12細(xì)胞OD值及細(xì)胞存活率的比較(s)

與對照組比較:1)P＜0.05;與Aβ?lián)p傷組比較:2)P＜0.05，下表同

組別 OD值 細(xì)胞存活率(%)2.532±0.22 100.00±8.69 Aβ?lián)p傷組 1.678±0.161) 66.27±6.321)bFGF組(25 ng/L)1.863±0.142) 73.58±5.532)bFGF組(50 ng/L)1.967±0.232) 77.69±9.082)bFGF組(75 ng/L)2.042±0.182) 80.64±7.112)bFGF組(100 ng/L)2.157±0.122) 85.19±4.742)對照組

表2 p-ERK1/2和PKCγ蛋白表達(dá)灰度值分析(s)

表2 p-ERK1/2和PKCγ蛋白表達(dá)灰度值分析(s)

與對照組比較:1)P＜0.05

組別 p-ERK1 p-ERK2 PKCγ

2.2 ERK1/2(p-ERk1/2)和PKCγ蛋白表達(dá)量變化 如圖1和表2所示，與正常對照組比較，Aβ?lián)p傷組p-ERK1/2和PKCγ蛋白表達(dá)均顯著下降(P＜0.05)，表明 Aβ25～35具有抑制PC12細(xì)胞p-ERK1/2和PKCγ蛋白表達(dá)作用。由圖2和表3可見，bFGF組p-ERK1/2和PKCγ蛋白表達(dá)水平高于 Aβ?lián)p傷組(P＜0.05)，提示bFGF具有增強AD模型細(xì)胞ERK1/2活力的作用，且與bFGF藥物濃度呈正相關(guān)(r=0.785，P=0.01)。圖3和表4顯示，抑制劑組PC12細(xì)胞p-ERK1/2和PKCγ蛋白表達(dá)量顯著低于bFGF組(P＜0.05)，并與PD98059藥物濃度呈正相關(guān)(r=0.85，P=0.01)。說明bFGF增強AD模型細(xì)胞ERK1/2活力和PKCγ蛋白表達(dá)的作用可被PD98059所抑制。

圖3 抑制劑PD98059各亞組和bFGF(50 ng/ml)組PC12細(xì)胞p-ERK1/2和PKCγ蛋白表達(dá)量變化

表3 p-ERE1/2和PKCγ蛋白表達(dá)灰度值分析(s)

表3 p-ERE1/2和PKCγ蛋白表達(dá)灰度值分析(s)

與Aβ?lián)p傷組比較:1)P＜0.05

組別 p-ERK1 p-ERK2 PKCγ 100.65±23.64 113.45±22.35 89.98±19.75 25 ng/ml bFGF組112.37±21.161)119.67±22.072)114.67±21.343)50 ng/ml bFGF組125.45±22.631)135.85±21.442)129.43±19.653)75 ng/ml bFGF組141.52±22.561)148.08±23.172)151.48±15.253)100 ng/ml bFGF組195.33±28.321)199.93±29.132)205.77±26.453)F值A(chǔ)β?lián)p傷組39.68 38.52 25.42

表4 p-ERK1/2和PKCγ蛋白表達(dá)灰度值分析(s)

表4 p-ERK1/2和PKCγ蛋白表達(dá)灰度值分析(s)

與bFGF組比較:1)P＜0.05

組別 p-ERK1 p-ERK2 PKCγ 1

3 討論

PKC是Ca2+-磷脂依賴性絲-蘇氨酸蛋白激酶，為酪氨酸蛋白激酶下游分子。激活后可引起多種細(xì)胞內(nèi)磷酸化，從而啟動和調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如突觸可塑、神經(jīng)遞質(zhì)釋放，其中包括GABA等;還可激活Bcl-2而產(chǎn)生抗凋亡作用。研究表明，ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)呈廣泛表達(dá)，各種細(xì)胞外刺激信號均可通過ERK1/2通路影響突觸傳遞和神經(jīng)元重塑、形態(tài)分化和生存等，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病的病理過程〔8〕。本實驗證實，bFGF可抑制Aβ25～35對PC12細(xì)胞的損傷作用，這一保護作用的可能機制是通過影響PKCγ蛋白表達(dá)和ERK1/2活性而實現(xiàn)的，為bFGF通過PKCγ和ERK1/2信號途徑治療AD提供實驗依據(jù)。

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