章海風 陳 敏 路新國 燕憲濤 丁連翠 吳志嵩 (揚州大學營養(yǎng)系，江蘇 揚州 225127)

尋求有效的抗氧化物質拮抗晶狀體的氧化損傷，延緩晶狀體的氧化損傷的發(fā)生、發(fā)展，將成為預防年齡相關性視功能障礙的重要手段之一。根據(jù)前期的文獻統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，枸杞子和菊花都具有明目，抗氧化抗衰老之功效，也是中醫(yī)眼科方劑中高頻用藥〔1〕。我們采用自然衰老大鼠模型，研究枸杞子和菊花的混合提取液對年齡相關性晶狀體氧化損傷的直接保護作用，以期為年齡相關性視功能障礙的預防和治療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 樣品液制備 枸杞菊花水提液制備:市售寧夏枸杞、汞菊按1∶1稱重，除雜后60℃干燥箱中干燥3 h，冷卻后，中藥粉碎機粉碎。固液比1∶10，80℃水浴浸提3 h，過濾，濾液再加5倍蒸餾水同法浸提2 h，合并濾液，濾液于旋轉蒸發(fā)儀中濃縮，最后用蒸餾水調整至0.4 g/ml，按人與大鼠用藥比設置0.5(3.5倍)、1.0(7倍)、2.0 g/kg(14倍)(生藥/大鼠體重)等低、中、高三個劑量組。4℃保存。明目地黃丸樣品液制備:明目地黃丸粉碎后按人用藥量7倍加入雙蒸水，80℃水浴溶解2 h，作為陽性對照組。4℃保存。

1.2 試劑與儀器 丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)及蛋白定量(雙縮脲法)測試盒均購自南京建成生物工程研究所;寧夏枸杞、貢菊、明目地黃丸購自揚州市四望亭大藥房;冰醋酸、無水乙醇等試劑購自揚州雙博化工公司;電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;DGF30/7-IA型電熱鼓風干燥箱，南京實驗儀器廠;中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;優(yōu)普超純水系統(tǒng);數(shù)顯恒溫水浴箱HH-8，國華電器有限公司;旋轉蒸發(fā)器RE-52B，上海亞榮生化儀器廠;超速高速冷凍離心機，貝克曼庫爾特公司;低速離心機;Spectrumlab 755s紫外可見分光光度計，上海棱光技術有限公司;PHS-3C PH計，上海精科儀器有限公司;裂隙燈顯微鏡(江蘇省蘇北人民醫(yī)院眼科中心)。

1.3 動物分組及實驗方案 56只清潔級SD大鼠〔許可證號為SCXK(蘇)2008-0004〕，其中3～4個月齡大鼠16只，雌雄各半，為青年對照組;20～22個月齡老年大鼠40只，雌雄各半。裂隙燈顯微鏡下排除眼疾個體，適應性飼養(yǎng)1 w后采用隨機分組法分成7組，每組8只，雌雄各半:青年中劑量組，青年陰性對照組(生理鹽水)，老年陰性對照組(生理鹽水)，干預低、中、高劑量組，明目地黃丸組。飼養(yǎng)于揚州大學醫(yī)學院動物房。飼養(yǎng)條件:環(huán)境溫度22℃ ～27℃，相對濕度50% ～70%，晝夜明暗交替時間12 h/12 h。每組動物喂以標準飼料。采用灌胃給藥方式。給藥劑量1 ml/100 g(體重)，每天上午給藥1次，共30 d。30 d后對所有大鼠進行裂隙燈顯微鏡檢查，拉頸椎處死大鼠，立即摘取眼球，分離晶狀體，稱重后加入9倍預冷生理鹽水勻漿，所有操作都在冰浴上進行。勻漿液平均分成兩份，一份用于CAT、MDA測定，一份低溫離心后，收集上清液，用于TAOC測定。

1.4 方法 晶狀體蛋白含量測定采用雙縮脲法，晶體T-AOC測定采用比色法，MDA測定采用硫代巴比妥酸法，CAT測定采用紫外分光法，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件，多組均數(shù)進行方差齊性檢驗和單因素方差分析和兩兩比較采用Scheffe法。

2 結果

2.1 一般情況 30 d飼養(yǎng)后，各組進食量和體重均無顯著差異(P＞0.05)，但從外表觀察，干預高劑量組和明目地黃丸組的大鼠皮毛較為稀疏，無光澤，個別大鼠出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，可能是年齡較大的個體差異。

2.2 各組大鼠晶狀體MDA含量 各組大鼠晶狀體MDA含量見表1。老年組大鼠晶狀體MDA含量明顯高于青年組;青年中劑量用藥組MDA含量明顯低于青年陰性對照組(P＜0.01);與老年陰性對照組相比，老年干預低、中、高劑量組和明目地黃丸組的MDA含量明顯降低(P＜0.01)，三個劑量組之間的MDA含量梯度差異顯著(P＜0.01)，但干預高劑量組與明目地黃丸組無顯著差異(P＞0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠晶狀體T-AOC、CAT活性 青年藥物組T-AOC、CAT活性顯高于青年空白組(P＜0.01);與老年陰性對照組相比，老年低、中、高劑量組和陽性對照組的T-AOC和CAT活性顯著升高(P＜0.01);與低劑量組相比，中、高劑量組的T-AOC、CAT活性明顯較高(P＜0.00)，但中、高劑量組和陽性對照組之間無顯著差異(P＞0.05);青年空白組T-AOC、CAT活力明顯高于老年陰性對照組(P＜0.01)。見表1。

表1 各組MDA、T-AOC、CAT含量比較( s，n=8)

表1 各組MDA、T-AOC、CAT含量比較( s，n=8)

組別 MDA(nmol)T-AOC(U)CAT(U)43.17±1.33 1.10±0.05 76.30±2.84青年陰性對照組 68.86±2.38 0.90±0.04 68.41±2.47老年陰性對照組 87.24±2.10 0.76±0.03 43.11±2.54干預低劑量組 75.50±1.86 0.86±0.04 56.72±2.85干預中劑量組 61.08±2.81 0.95±0.02 63.93±2.68干預高劑量組 69.59±3.00 0.98±0.02 67.61±3.10明目地黃丸組青年中劑量組65.59±2.54 0.93±0.02 63.24±2.55

3 討論

老齡生物可隨年齡遞增而出現(xiàn)全身各器官系統(tǒng)的退行性改變，其機制之一是老齡生物組織和細胞的抗氧化能力下降。近年研究表明白內障等眼疾的發(fā)生與脂質過氧化物有關，氧自由基誘發(fā)的脂質過氧化物是晶狀體衰老的病理基礎。機體受氧化損傷與否，不僅取決于致病因素的強弱，更重要的是機體內是否存在完善的抗氧化防御機制。眼組織中也存在抗氧化防御系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶(SOD)、CAT、過氧化物酶等。這些抗氧化物質可維持著晶狀體的透明，延緩白內障的發(fā)生發(fā)展。但當長期與光接觸、衰老等原因引起晶狀體組織抗氧化防御功能不足時，則可能發(fā)生氧化損傷，進而形成白內障。

MDA是自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質過氧化作用所形成的脂質過氧物。MDA的量可反映機體內脂質過氧化的程度，間接反映細胞損傷的程度。同時，脂質過氧化產(chǎn)物又可進一步引起細胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠晶狀體MDA含量自出生后1個月起處于低水平上升過程，3個月至12個月基本穩(wěn)定，自12個月開始急劇上升，表明晶狀體氧化損傷嬰幼兒、少年、青中年程度大致相當，自中年起始氧化損傷進行性急劇加重〔2〕。Yildirim等〔3〕測定30個AMD患者與60個健康者紅細胞的CAT活性和MDA血漿水平，AMD患者CAT活性顯著低于健康者，MDA水平高于健康者，與本實驗結果相一致。有資料顯示，枸杞及菊花中有效成分能有效清除自由基，減少脂質過氧化物的形成。如枸杞中的枸杞多糖具有調節(jié)機體免疫、抗腫瘤等功能〔4～6〕。菊花中所含黃酮類化合物，如槲皮素、芹菜素、木樨草素、蘆丁等具有較強的抗氧化防衰老的功效〔7〕。單鐵英等〔8〕研究認為枸杞多糖可有效抑制其表達，顯著改善實驗性食管癌大鼠細胞免疫功能障礙。胡春等〔9〕也研究發(fā)現(xiàn)，菊花提取物對生物膜的超氧陰離子自由基損傷具有明顯保護作用，主要是通過直接進入細胞膜的甘油酯后而起保護作用。汪朝陽等〔10〕研究表明枸杞多糖對氧化損傷大鼠晶狀體上皮細胞的凋亡有抑制作用。祁明信等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)菊花可能通過Ca2+、cAMP和cGMP信號傳導系統(tǒng)及其相互作用調節(jié)生物學效應，防護晶狀體上皮細胞氧化損傷及減少細胞凋亡的細胞和分子生物學機制。本實驗結果顯示，枸杞菊花提取液組大鼠鼠晶狀體中MDA含量顯著降低，充分說明了該提取成分具有拮抗過氧化損傷的作用，可有效延緩老年晶狀體的氧化損傷。

自由基是生物體正常代謝過程中不斷產(chǎn)生的損害自身的毒性產(chǎn)物。其中氧自由基可以引發(fā)脂類發(fā)生過氧化反應，但由于正常機體中存在著天然的自由基清除劑和抗氧化系統(tǒng)，使自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，保持機體不受自由基的損害。如細胞內存在清除氧自由基的體系，即在需氧代謝細胞中都含有CAT，它可能促使超氧化物陰離子變?yōu)镠2O2和氧分子，清除氧自由基保護細胞免受損傷。通過試驗看出，枸杞菊花提取液可以提高大鼠晶狀體中CAT的活性，同時能夠防止膜脂的過氧化，2.0 g/kg的枸杞菊花提取液對大鼠晶狀體中T-AOC活力有顯著提高作用，說明該提取液對老年大鼠的晶狀體過氧化損傷有一定的預防作用。

本實驗結果表明枸杞和菊花的水提液能通過降低過氧化物(MDA)水平，提高CAT活性和T-AOC活性來增強晶狀體的抗氧化系統(tǒng)，可延緩晶狀體老化損傷，不僅可減慢晶狀體彈性的下降，也可預防白內障的發(fā)生。

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