唐志斌，廖 瑛

（南華大學第一附屬醫(yī)院骨外科，湖南 衡陽 421001）

microRNA是近年來發(fā)現(xiàn)于真核細胞中的一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，它在調控基因的轉錄和蛋白翻譯中發(fā)揮重要的作用，是近年來生命科學的研究熱點，人類miRNA通過調控其靶基因的表達及相關信號通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉歸過程中發(fā)揮重要作用［1］。研究表明，miR-124在宮頸癌和肝癌組織中表達下調，miR-124可通過靶向ITGB1抑制口腔鱗狀細胞癌的生長，也可通過靶向CDK6抑制髓母細胞瘤細胞的生長與浸潤［2-5］。本文采用MTT檢測miR-124對人成骨肉瘤MG-63細胞增殖的影響，為進一步闡明成骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系

MG-63細胞為人成骨肉瘤細胞系，購自北京協(xié)和細胞生物所。MG-63細胞培養(yǎng)于含15%小牛血清的MEM培養(yǎng)基（Gibco公司）。

1.1.2 試劑

MTT為Sigma產(chǎn)品；脂質體2000購自Invitrogen公司；miR-124模擬物與抑制劑購自上海吉瑪生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

MG-63細胞常規(guī)培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 細胞轉染

1×104細胞于96孔板中，完全培養(yǎng)基中細胞生長至30%匯合期。加入2.5μL的脂質體于100μL無血清培養(yǎng)基中混勻靜置15min，稀釋12.5pmol的miR-124模擬物或抑制劑于50μL無血清培養(yǎng)基中，混合上述脂質體與DNA稀釋液，室溫放置30min；分別用PBS與無血清培養(yǎng)基洗滌細胞；將上述混合物加入96孔板中，然后再加100μL無血清培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)6h；棄上清，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)過夜。

1.2.3 MTT法測定

設立空白對照組、脂質體組、miR-124模擬物組以及miR-124抑制劑組。每組設立4個重復孔，分別在轉染24h、48h和72h后，每孔加入 MTT溶液（5mg／ml）20μL，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲亞砜，震蕩10min，選擇570nm波長，在酶標儀上測定各孔的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 miR-124模擬物對人成骨肉瘤MG-63細胞增殖活性的影響

人成骨肉瘤MG-63細胞經(jīng)miR-124模擬物處理后，細胞生長明顯比未處理細胞的生長減緩；處理24h、48h、72h后其吸光值 A值分別為（0.149±0.006）、（0.163±0.007）、（0.212±0.009），分別與對照組（0.261±0.017）、（0.379±0.021）、（0.414±0.031）相比，均顯著下調，具有顯著抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示miR-124模擬物可抑制人成骨肉瘤MG-63細胞增殖活性。

2.2 miR-124抑制劑對人成骨肉瘤MG-63細胞增殖活性的影響

人成骨肉瘤MG-63細胞經(jīng)miR-124抑制劑處理后，細胞生長明顯比未處理細胞的生長迅速；處理24h、48h、72h后其吸光值 A值分別為（0.313±0.016）、（0.542±0.033）、（0.713±0.041），分別與對照組（0.261±0.017）、（0.379±0.021）、（0.414±0.031）相比，均顯著上調，具有顯著促進作用，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示miR-124抑制劑可促進人成骨肉瘤MG-63細胞增殖活性。

3 討論

骨肉瘤又稱成骨肉瘤，是惡性骨腫瘤中最常見惡性程度最高的一種，又分為成骨性骨肉瘤及溶骨性骨肉瘤兩類。發(fā)病年齡多在15～25歲。70%以上的患者發(fā)生在股骨遠端和脛骨近端。惡性腫瘤難以治愈的主要原因就是不容易早期診斷，一旦確診，大多數(shù)已經(jīng)到中晚期，已形成較廣泛的浸潤或轉移，臨床治療效果差。成骨肉瘤肺轉移是目前導致患者治療失敗和死亡的最主要的原因。

miRNA是新近證明的一類長約19～25nt的內(nèi)源性非編碼的小分子RNA，在多個物種中廣泛存在，包括動物、植物和病毒。目前，被證實的小RNA就有500多種，而計算機預測可能會超過1000個，且約1／3的人類基因被小RNA調控。隨著更多的miRNA被鑒定和深入研究，越來越多的證據(jù)表明，miRNA在細胞生長、增殖、發(fā)育和凋亡過程中扮演著重要角色，并與多種腫瘤的發(fā)生有關。目前，有研究利用針對目的miRNA進行模擬物過表達或者抑制劑干擾miRNA來研究各種miRNA在細胞中的生物學功能［6］。miR-124在多種腫瘤組織和細胞中表達下調［2-5］，本研究顯示miR-124的模擬物及抑制劑分別可抑制和促進人成骨肉瘤MG-63細胞生長增殖活性，提示miR-124可能作為抑瘤基因miRNA參與成骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。

miRNA可以作為新的分子標志物用于惡性腫瘤的早期診斷和預后預測，將展示出廣闊的臨床應用前景。針對miR-124建立行之有效的檢測手段以及靶向治療策略，為進一步闡明成骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，將為成骨肉瘤早期診斷、治療方案選擇、療效評價以及預后判斷提供重要的理論和實驗依據(jù)。綜上所述，miR-124有調控骨肉瘤細胞的增殖能力，miRNA是一種天然的反義作用因子，利用miRNA模擬物或抑制劑可能成為基因治療骨肉瘤的一個新的研究方向。但miR-124不是骨肉瘤中唯一異常表達的miRNA，因此應該找出更多異常表達的miRNA分子，發(fā)現(xiàn)它們之間的聯(lián)系，為更好理解骨肉瘤的發(fā)生機制及骨肉瘤的基因治療提供更好的理論支持。

［1］ZHANG L，DENG T，LI X，et al.microRNA-141is involved in a nasopharyngeal carcinoma-related genes network［J］.Carcinogenesis.2010，31（4）：559-66.

［2］FURUTA M，KOZAKI KI，TANAKA S，et al.miR-124and miR-203are epigenetically silenced tumor-suppressive microRNAs in hepatocellular carcinoma.Carcinogenesis［J］.2010，31（5）：766-76.

［3］LI KK，PANG JC，CHING AK，et al.miR-124is frequently down-regulated in medulloblastoma and is a negative regulator of SLC16A1［J］.Hum Pathol，2009，40（9）：1234-43.

［4］PIERSON J，HOSTAGER B，F(xiàn)AN R，et al.Regulation of cyclin dependent kinase 6by microRNA 124in medulloblastoma［J］.J Neurooncol，2008，90（1）：1-7.

［5］HUNT S，JONES AV，HINSLEY EE，et al.MicroRNA-124 suppresses oral squamous cell carcinoma motility by targeting ITGB1［J］.FEBS Lett，2011，585（1）：187-92.

［6］吳子晏，劉小云，楊述華，等.miR-21對骨肉瘤細胞增殖的影響［J］.中國癌癥雜志，2010，20（8）：561-564.