唐文莊，鐘良寶

（海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，海南 ?？?570102）

·實驗研究·

糖尿病C57BL/6小鼠STZ劑量的選擇及CD2AP在糖尿病腎病蛋白尿進展中的表達變化

唐文莊，鐘良寶*

（海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，海南 ?？?570102）

目的 探索不同STZ劑量對C57BL/6小鼠糖尿?。―M）模型的影響和CD2相關(guān)蛋白（CD2AP）在糖尿病腎病蛋白尿進展中的表達變化。方法 采用雄性近交系C57BL/6小鼠，以110mg/kg、130mg/kg和150mg/kg的STZ用量分別一次性腹腔注射誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型，72h后檢測小鼠的成模率。小鼠代謝籠收集DM小鼠24h尿量，Bradford法進行24h尿蛋白定量，觀察蛋白尿出現(xiàn)的時間。STZ注射后喂養(yǎng)12周，統(tǒng)計各組DM小鼠的死亡率，檢測DM小鼠相關(guān)血尿生化指標(biāo)及腎臟病理變化。RT-PCR檢測糖尿病模型制備后第1、2、3、4、6、8、10、12周糖尿病小鼠CD2AP表達的變化。結(jié)果 130mg/kg劑量的STZ能較好誘導(dǎo)DM的發(fā)生(成模率為90%)，且血糖水平不至于過高[(21.16±2.46)mmol/L]。12周后，該組DM小鼠的死亡率遠低于150mg/kg STZ注射組(22.2%vs 60.0%，P＜0.05)。C57BL/6DM小鼠蛋白尿出現(xiàn)的時間為STZ注射后(17.2±5.8)d。CD2AP在糖尿病小鼠的腎臟有穩(wěn)定的表達，且自第3周開始，CD2AP的表達開始出現(xiàn)明顯的下調(diào)。結(jié)論 130mg/kg的STZ劑量是一次性誘導(dǎo)C57BL/6小鼠糖尿病腎病模型的最佳劑量；DM小鼠蛋白尿的出現(xiàn)可能與CD2AP的表達下調(diào)有關(guān)。

糖尿病；糖尿病腎??；CD2AP；模型；小鼠

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)常見的慢性微血管并發(fā)癥之一。一次性大劑量注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的速發(fā)型DM模型在糖尿病腎病的研究中較為常用，蛋白尿的出現(xiàn)是腎臟受累的主要外在指征[1-2]。然而，酮癥酸中毒、感染、抵抗力低下等因素導(dǎo)致DM動物模型的死亡率較高，尤其是DM小鼠。此外，由于存在個體差異，部分小鼠在DM出現(xiàn)后相當(dāng)長的一段時間并不出現(xiàn)明顯的蛋白尿[3]。因此，降低糖尿病小鼠的死亡率和準(zhǔn)確觀察腎臟受累的情況對長程研究DN小鼠尤為重要。CD2AP是近年來發(fā)現(xiàn)的與蛋白尿發(fā)生密切相關(guān)的腎小球裂孔隔膜分子[4]。其在蛋白尿發(fā)病中的作用機制目前尚未闡明。本研究初步探索CD2AP在糖尿病腎病進展中的一般特點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 100只7周齡雄性C57BL/6小鼠購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院器官移植所，體重22～28g。標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房籠子喂養(yǎng)，并飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水。室溫23℃～28℃，相對濕度50%～80%。小鼠代謝籠由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)購自美國 Sigma公司。Trizol、DNaseⅠ均購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqDNA聚合酶購自立陶宛MBI公司。引物設(shè)計參照GenBank中的mRNA序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 動物分組及DM模型的建立 隨機將35只C57BL/6小鼠分為四組：正常對照組(Control)，5只；STZ110mg/kg注射組(STZ110)，10只；STZ 130mg/kg注射組(STZ130)，10只；STZ 150mg/kg注射組(STZ150)，10只。所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后禁食12h。將STZ溶于無菌的0.1mol/L的pH 4.5檸檬酸緩沖液中，終濃度為1%。按以上不同劑量對小鼠進行一次性腹腔注射STZ，對照組腹腔注射等量無菌檸檬酸緩沖液。注藥后72h小鼠尾尖取血，測血糖(One TouchⅡ血糖儀，美國強生公司)，血糖≥16.7mmol/L者確定為DM誘導(dǎo)成功。統(tǒng)計不同STZ劑量下小鼠的DM模型的成功率。

1.3 蛋白尿的監(jiān)測 將DM小鼠置于小鼠代謝籠喂養(yǎng)，定期監(jiān)測血糖和收集24h尿量，采用考馬斯亮藍微量測定法進行24h尿蛋白定量。本研究中小鼠蛋白尿的診斷標(biāo)準(zhǔn)以文獻[5]中的小鼠尿蛋白的正常范圍為參照，即正常小鼠24h尿蛋白為(5～19)μg/體重(g)。若尿蛋白定量超過正常范圍，且大于原24h尿蛋白量150%，連續(xù)出現(xiàn)2d以上者確定為小鼠病理性蛋白尿。所有小鼠精心喂養(yǎng)12周，對小鼠的生存狀況做精確的記錄，包括尿量、飲水量、血糖、尿糖、蛋白尿出現(xiàn)的時間、體重及有無死亡等。

1.4 標(biāo)本采集及生化指標(biāo)檢測 實驗結(jié)束前1d，用小鼠代謝籠收集24h尿量，稱小鼠體重，測血糖；摘取小鼠眼球，由眼動脈處采集小鼠血液標(biāo)本；留取雙腎組織，剝離被膜，測量小鼠腎重，計算單側(cè)腎重與體重的比值，即為小鼠的腎重指數(shù)。將小鼠腎臟固定于10%的中性甲醛中，石蠟包埋；用日本Autoanalyzer Hitachi 7150型全自動生化分析儀檢測小鼠血尿生化指標(biāo)，包括：肌酐、血尿素氮(BUN)、Na+和K+等。以血、尿肌酐值計算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr=尿肌酐/血肌酐×每分鐘尿量)，以此代表小鼠腎小球濾過率，并按小鼠體重進行標(biāo)準(zhǔn)化 [μl/min·BW(g)][6]。尿蛋白定量仍采用Bradford法[7]。

1.5 腎臟病理改變 將石蠟包埋的小鼠腎臟組織切為厚2μm的病理切片，經(jīng)PAS和Masson染色后，光鏡下觀察腎臟病理改變。

1.6 RT-PCR檢測CD2AP在蛋白尿進展中的表達變化 以130mg/kg的STZ制備7周齡C57BL/6小鼠糖尿病模型(65只)，并設(shè)正常對照組小鼠5只。剔除未成模小鼠，分別于第1、2、3、4、6、8、10、12周各處死5只小鼠，取各組小鼠腎臟皮質(zhì)，用Trizol抽提各組小鼠腎皮質(zhì)總RNA，DNaseⅠ去除RNA中痕量的基因組DNA，合成cDNA。CD2AP引物正義鏈：5'-CGA GTT GGG GAA ATC ATC AG-3'，反義鏈：5'-TGAGGTAGG GCCAGT CAAAG-3'，產(chǎn)物大?。?04bp；內(nèi)參照GAPDH引物正義鏈：5'-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG-3'反義鏈：5'-GAG GGG CCATCCACAGTC TTC-3'，產(chǎn)物大?。?57bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，然后進入94℃30s、55℃45s、72℃ 1min的熱循環(huán)共30個，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物電泳后用自動凝膠成像分析儀及其圖象分析系統(tǒng)軟件進行分析，以CD2AP與GAPDH吸光度比值表示CD2AP的表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，兩組間均數(shù)比較采用成組t檢驗，相關(guān)分析采用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 STZ劑量與血糖水平、DM成模率、小鼠死亡率的關(guān)系 STZ注射72h，正常對照組小鼠的血糖為(5.34±0.77)mmol/L；STZ110mg/kg劑量誘導(dǎo)后小鼠的成模率僅為20%，130mg/kg和150mg/kg劑量的成模率分別達到90%和100%，但STZ150組平均血糖水平明顯高于STZ130組(P＜0.05)。Pearson相關(guān)分析顯示血糖水平與STZ劑量之間有明顯的相關(guān)性(r=0.993，P=0.007)。在110mg/kg STZ注射組中，未成模小鼠血糖水平與正常小鼠比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，如表1所示。

表1 STZ劑量與血糖水平、DM成模率、小鼠死亡率的關(guān)系(±s)

表1 STZ劑量與血糖水平、DM成模率、小鼠死亡率的關(guān)系(±s)

組別 只數(shù)成模數(shù)[只(%)]DM鼠血糖水平(mmol/L)未成模小鼠血糖水平(mmol/L)12周后DM鼠死亡數(shù)[只(%)]Control STZ110STZ130STZ15051010100(0)2(20)9(90)10(100)-20.95±0.9221.16±2.4625.72±1.47*5.34±0.776.89±1.93#7.2--0(0.0)2(22.2)6(60.0)*

同等條件下喂養(yǎng)DM小鼠12周后，130mg/kg STZ注射組DM小鼠死亡率為22.2%，而150mg/kg STZ注射組DM小鼠死亡率達60.0%。對DM小鼠進行回顧性分析，死亡DM小鼠(8只)造模時血糖為(25.84±1.35)mmol/L，未死亡DM小鼠(13只)造模時血糖為(22.15±2.16)mmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，高血糖引起的酮癥酸中毒為小鼠死亡的主要原因。

13只DM小鼠STZ誘導(dǎo)前24h尿量為(1.62±0.22)ml，24h尿蛋白定量為(0.25±0.06)mg。DM誘導(dǎo)成功后其尿量顯著增多，在STZ注射后第1周24h尿量達到(5.43±0.61)ml，但24h尿蛋白定量并未有明顯的增加(P＞0.05)。DM小鼠蛋白尿出現(xiàn)的時間為(17.2±5.8)d。隨著時間的延長，DM小鼠的24h尿量及24h尿蛋白定量呈逐步遞增趨勢，如圖1所示。

2.2 DM小鼠24h尿量及蛋白尿出現(xiàn)的時間 剔除實驗中不同時期死亡的8只DM小鼠，剩余13只DM小鼠STZ誘導(dǎo)前24h尿量為(1.62±0.22)ml，24h尿蛋白定量為(0.25±0.06)mg。DM誘導(dǎo)成功后其尿量顯著增多，在STZ注射后第1周24h尿量達到(5.43±0.61)ml，但24h尿蛋白定量并未有明顯增加(P＞0.05)。DM小鼠蛋白尿出現(xiàn)的時間為(17.2±5.8)d。隨著時間的延長，DM小鼠的24h尿量及24h尿蛋白定量呈逐步遞增趨勢，如圖1所示。

圖1 不同時間點DM小鼠24h尿量及24h尿蛋白定量

2.3 腎臟生化指標(biāo)的改變 糖尿病小鼠的腎重指數(shù)、血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)和GFR均明顯高于正常對照組小鼠(P＜0.05)，但血清肌酐水平未見明顯升高(P＞0.05)；在血電解質(zhì)指標(biāo)上，糖尿病小鼠血清Na+濃度低于正常對照小鼠，而血清K+較正常小鼠有所增高(P＜0.05)，見表2。

表2 第12周各組小鼠生化指標(biāo)（±s）

表2 第12周各組小鼠生化指標(biāo)（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別GFR[μl/min.BW(g)]2.84±0.547.13±0.84*只數(shù)正常對照組糖尿病組513腎重指數(shù)(mg/g)13.94±1.4319.43±2.16*血糖(mmol/L)5.54±0.8026.62±2.24*血HbA1c(%)3.85±0.578.45±0.88*血Na+(mmol/L)140.24±3.01135.67±3.50*血K+(mmol/L)6.28±0.687.55±1.62*血肌酐(μmol/L)8.52±1.617.73±3.05

2.4 腎臟病理變化 如圖2A、2C所示：正常對照組小鼠腎小球及腎小管未見明顯病理變化，而糖尿病小鼠的腎小球體積明顯增大，腎小球腫脹，腎小囊擴張；腎小管上皮細胞濁腫；近端腎小管刷狀緣脫落。PAS染色下，腎小球基底膜增厚，腎小球系膜細胞增生，系膜區(qū)增寬等病變明顯可見(圖2B)。Masson染色下，細胞核呈紅色，基底膜膠原纖維呈藍色，系膜水腫區(qū)呈淡藍色，但未見腎間質(zhì)纖維化，未見明顯炎性細胞浸潤(圖2D)。

圖2 第12周小鼠腎臟病理變化

2.5 CD2AP在蛋白尿進展中的表達變化 CD2AP mRNA在正常組及第1、2周糖尿病小鼠的腎臟皮質(zhì)中有穩(wěn)定的表達，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。自第3周起，DM組小鼠腎臟皮質(zhì)CD2AP mRNA的表達開始出現(xiàn)下調(diào)，隨著病程的延長呈遞減趨勢，在觀察期限的第12周表達最低(圖3)。

圖3 CD2AP在各組小鼠腎臟皮質(zhì)中的表達

3 討論

STZ對胰島β細胞具有高度選擇性毒性作用，主要通過直接破壞胰島β細胞或通過自身免疫機制導(dǎo)致β細胞損傷，使胰島素分泌不足，表現(xiàn)為糖尿病特點。已有研究表明STZ的劑量與胰島的損傷程度呈明顯的正相關(guān)[8]。文獻報道[9]小鼠的STZ使用劑量多為25～150mg/kg，亦有可達250mg/kg，一次性腹腔注射150mg/kg較常用。本研究發(fā)現(xiàn)，STZ劑量與糖尿病小鼠的成模率、血糖水平密切相關(guān)，高血糖導(dǎo)致的代謝紊亂是實驗小鼠死亡的主要原因，選擇STZ劑量是實驗的關(guān)鍵。C57BL/6小鼠在110mg/kg STZ劑量誘導(dǎo)下，多數(shù)不表現(xiàn)為糖尿病，但其血糖水平仍高于正常對照小鼠，反映出STZ對胰島有損傷，但有限。隨著STZ劑量的增大，小鼠的血糖水平隨之增加，DM成模率增高。糖尿病小鼠因高糖血癥導(dǎo)致代謝紊亂，機體抵抗力低下，因而在實驗過程中有較高的死亡率。在本研究中，12周內(nèi)不同劑量誘導(dǎo)組小鼠的死亡率比較，STZ劑量大者，小鼠血糖水平高，其死亡的機會大。所以，130mg/kg的STZ劑量在DM小鼠存活上比應(yīng)用高劑量STZ者有明顯的優(yōu)勢。

正常小鼠每日亦有少量的尿蛋白排泄[5]。實驗中，對C57BL/6DM小鼠24h尿蛋白量進行監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，STZ注射后第10天，即有個別小鼠開始出現(xiàn)蛋白尿，但大多數(shù)小鼠蛋白尿出現(xiàn)的時間主要集中出現(xiàn)在第3周。蛋白尿的出現(xiàn)是腎臟受累的明顯特征，表明了糖尿病的并發(fā)癥—糖尿病腎病的產(chǎn)生[10]。目前，越來越多的證據(jù)表明蛋白尿是腎臟損傷進行性加重的重要原因，積極干預(yù)蛋白尿的產(chǎn)生對延緩腎功衰的重要性[11]。

基質(zhì)增生和間質(zhì)纖維化是糖尿病腎病進展的主要病理特征[12]。為了了解C57BL/6小鼠12周后腎臟病變程度、病理分期及機體狀況，我們檢測了相關(guān)血尿生化指標(biāo)及腎臟病理改變。腎小球濾過率的結(jié)果提示此期DM小鼠腎臟仍然處于高濾過狀態(tài)；因高濾過、水腫導(dǎo)致的腎臟肥大，加之DM小鼠消瘦、體重減輕，故腎重指數(shù)明顯增加。血肌酐的結(jié)果表明DM小鼠腎功能仍在正常范圍。部分小鼠可以檢測到低Na+、高K+血癥，這可能與高血糖引起的滲透性利尿作用有關(guān)。腎臟病理主要以腎小球體積增大及基底膜增厚為主，伴有小管間質(zhì)的水腫。Masson染色未見腎臟有明顯的纖維化病變，說明DM小鼠12周的病程尚不足以引起腎臟進入終末腎衰竭的階段。根據(jù)Mogensen對DN的分期標(biāo)準(zhǔn)[13]，我們研究中STZ注射12周的小鼠主要處于DNⅢ期。

在此基礎(chǔ)上，我們還初步探討了CD2AP在糖尿病腎病進展中的表達規(guī)律。CD2AP在腎臟主要表達于腎小球上皮細胞(足細胞)和腎小管上皮細胞，它作為細胞內(nèi)骨架蛋白間的銜接蛋白可能發(fā)揮著細胞粘附、遷移和形態(tài)維持等的功能[14]。研究中我們發(fā)現(xiàn)，CD2AP在正常腎臟有較高水平的表達，在蛋白尿出現(xiàn)之前2周內(nèi)，CD2AP的表達無明顯改變。當(dāng)糖尿病小鼠在第3周開始出現(xiàn)病理性蛋白尿即糖尿病腎病的時候，CD2AP的表達也開始出現(xiàn)下調(diào)。隨著病程的進展，DN小鼠的蛋白尿逐步增加，而CD2AP的表達呈逐步下降趨勢，兩者之間顯示出負相關(guān)性。CD2AP這種表達的下調(diào)與蛋白尿發(fā)生之間的因果關(guān)系怎樣？機制怎樣？這些均有待于我們下一步進行的深入研究。

本研究表明，一次性腹腔注射STZ劑量130mg/kg，近交系C57BL/6糖尿病小鼠在第3周左右開始出現(xiàn)明顯的蛋白尿，第12周腎臟組織為典型的Ⅲ期病理改變，此外，腎臟皮質(zhì)組織CD2AP的表達下調(diào)。故130mg/kg的STZ劑量是一次性誘導(dǎo)C57BL/6小鼠糖尿病腎病模型的最佳劑量；DM小鼠蛋白尿的出現(xiàn)可能與CD2AP的表達下調(diào)有關(guān)。

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Selection of Streptozotocin dose on experimental C57BL/6diabetic mice and the temporal expression of CD2AP during proteinuria progression.

TANG Wen-zhuang,ZHONG Liang-bao.Department of Nephropathy,the AffiliatedHospital of Hainan Medical University,Haikou 570102,Hainan,CHINA

Objective To determine the optimal dose of Streptozotocin(STZ)for the establishment of C57BL/6mouse model of diabetic nephropathy,and to study the temporal expression of CD2AP during proteinuria progression.Methods Male C57BL/6mice were induced by three STZ doses(i.e.110mg/kg,130mg/kg and 150mg/kg,respectively)through once intraperitoneal injection.Blood glucose was measured at 72h later.24h urine volume was collected by metabolic cage and 24h urine protein was detected by Bradford method to monitor the time when proteinuria occurred.Twelve weeks later,the mortality of DM mice,the biochemical values and renal pathology were studied respectively.The expression of CD2AP mRNA was measured by semi-quantitative RT-PC on the 1th,2th,3th,4th,6th,8th,10th,12thweek.Results STZ dose of 130mg/kg could successfully induce C57BL/6mice developing into DM state(90%)and ensure that the levels of blood glucose not too high[(21.16±2.46)mmol/L].Twelve weeks later,the STZ dose of 130mg/kg could effectively lessen the mortality of DM mice than 150mg/kg(22.2%vs 60%,P＜0.05).24h urine protein of DM mice was significantly elevated at(17.2±5.8)days since STZ injection.CD2AP could stably express in mice renal cortex,and exhibit a descending expression pattern since the third week after STZ injection.Conclusion 130mg/kg is the optimal dose of STZ to establish DN model with C57BL/6mice through once intraperitoneal injection.The occurrence and progression of proteinuria might closely correlated with the down-regulation of CD2AP.

Diabetes mellitus;Diabetic nephropathy;CD2AP;Model;Mouse

R749

A

1003—6350（2012）16—024—05

唐文莊（1975—），男，副主任醫(yī)師，學(xué)士。

*通訊作者：鐘良寶，教授。E-mail:zhonglb_5612@sina.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.16.009

2012-03-08)