丁金萍 孫恒赟 陳謹(jǐn)君 張文杰 劉偉 曹誼林 周廣東

軟骨組織工程技術(shù)出現(xiàn)至今，關(guān)于種子細(xì)胞的研究從未間斷，并且始終是一個(gè)核心問題。軟骨細(xì)胞是構(gòu)建軟骨最理想的種子細(xì)胞，但軟骨細(xì)胞來源有限，取材創(chuàng)傷大，大量擴(kuò)增后又極易發(fā)生老化與去分化[1]。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是研究較多的成體干細(xì)胞，但由于骨髓穿刺給患者帶來一定痛苦，而且細(xì)胞獲得量小，在臨床應(yīng)用中受到一定的限制。因此，如何獲得來源廣泛、數(shù)量充足、功能良好，且具有軟骨分化潛能的細(xì)胞，是解決軟骨組織工程種子細(xì)胞問題的關(guān)鍵。自Zuk等[2]成功分離培養(yǎng)出具有多向分化潛能的脂肪組織來源干細(xì)胞（ADSCs）以來，將其作為軟骨組織工程種子細(xì)胞的研究越來越多。但通常所稱的ADSCs是一群混雜細(xì)胞群[2]，其中一些脂肪前體細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等會影響ADSCs構(gòu)建軟骨的成功率和均質(zhì)性。我們的前期研究通過單細(xì)胞克隆培養(yǎng)及軟骨定向誘導(dǎo)技術(shù)，將具有克隆形成能力的ADSCs分為具有和不具有軟骨分化潛能的兩類克隆群，再結(jié)合基因芯片技術(shù)篩選出與軟骨分化潛能相關(guān)的表面膜蛋白；以此表面標(biāo)志為基礎(chǔ)，進(jìn)一步結(jié)合細(xì)胞分選，以及體外軟骨定向誘導(dǎo)技術(shù)，有可能找到適合組織工程軟骨構(gòu)建的ADSCs的新標(biāo)志。本研究就是基于基因芯片初篩所得的CD204（巨噬細(xì)胞清道夫受體)在兩類不同克隆群差異表達(dá)的結(jié)果，探討以CD204作為細(xì)胞分選標(biāo)志，研究分選后細(xì)胞體外成軟骨能力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

10 cm培養(yǎng)皿，離心管，0.22 μm針孔過濾器（Falcon公司）；低糖及高糖 DMEM培養(yǎng)液，MesenPRO RSTMMedium，青鏈霉素原液，0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）；0.25%氯霉素（上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院自制）；Ⅰ型膠原酶（Serva公司）；地塞米松、ITS+(Sigma公司)；Isotype鼠 IgG2B-PE 抗體， 鼠抗人 CD204-PE 抗體，TGF-β3，IGF，BMP-6(R&D公司)；鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（Dako公司）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司）；流式細(xì)胞分選儀（Beckman-coulter公司）。

1.2 脂肪來源干細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng)

脂肪組織來源于18～35歲要求行抽脂術(shù)的健康成年人2例，供體無傳染病及內(nèi)分泌疾病，平均抽脂吸出物800 mL。

分離抽脂術(shù)后抽吸物的脂質(zhì)部分約800 mL，用0.25%氯霉素和生理鹽水沖洗，用0.075%Ⅰ型膠原酶與脂質(zhì)成分等體積置于50 mL離心管，37℃恒溫?fù)u床反復(fù)震蕩消化40min。1500 r/min離心5min，去上清，低糖DMEM培養(yǎng)液重懸后100 μm金屬濾器過濾，1500 r/min離心5min，吸除上清液，沉淀重懸后按2×104cells/cm2密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16 h后進(jìn)行流式細(xì)胞分選。

1.3 流式細(xì)胞分選

標(biāo)本制備：原代細(xì)胞貼壁16 h后，用0.25%胰酶消化，單細(xì)胞濾器過濾，離心棄上清，PBS重懸，分blank組、isotype-PE組和 CD204-PE組，4℃孵育40min，PBS洗滌 3次，加 500μL PBS待上機(jī)。分選后的細(xì)胞用MesenPRO RS培養(yǎng)液按2×104cells/cm2密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 體外定向成脂、成骨分化

成脂誘導(dǎo)分化：取CD204+和CD204-的第2代細(xì)胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度到3000 cells/cm2。48 h后更換成脂誘導(dǎo)液DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，0.5 mM異丁基甲基黃嘌呤，1 μM地塞米松，10 μM胰島素，200 μM吲哚美辛），完全培養(yǎng)基組作為陰性對照。每3天更換培養(yǎng)液，定向誘導(dǎo)分化10 d后，行油紅O染色，觀察誘導(dǎo)分化結(jié)果。

成骨誘導(dǎo)分化：分別取分選擴(kuò)增后的第2代CD204+和CD204-細(xì)胞，胰蛋白酶消化，將細(xì)胞密度調(diào)整到 3000 cells/cm2。48 h后更換成骨誘導(dǎo)DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，50 μg/mL維生素C，0.1 μM 地塞米松，10 μM β-磷酸甘油鈉）， 完全培養(yǎng)基組作為陰性對照。每3天更換培養(yǎng)液，定向誘導(dǎo)分化14 d后，行茜素紅染色，觀察誘導(dǎo)分化結(jié)果。

1.5 細(xì)胞pellet培養(yǎng)及成軟骨誘導(dǎo)

分別取CD204+和CD204-的第2代細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，常規(guī)1500 r/min離心5min，MesenPRO RSTM培養(yǎng)液重懸后細(xì)胞計(jì)數(shù)，按0.5×106個(gè)細(xì)胞接種至15 mL離心管中，1080 r/min，37℃離心5min，即置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

細(xì)胞pellet靜置培養(yǎng)3 d后，每個(gè)15 mL離心管底可見細(xì)胞形成球狀，此時(shí)即可更換成軟骨誘導(dǎo)液。成軟骨誘導(dǎo)液配方：高糖DMEM，1×ITS+，10 ng/mL TGF-β3， 10 ng/mL BMP-6， 50 ng/mL IGF-1， 0.1 μM地塞米松，50 μg/mL 維生素 C，40 μg/mL 脯氨酸。成軟骨誘導(dǎo)4周后，進(jìn)行大體觀察和HE、Safranin O等組織學(xué)染色，以及Ⅱ型膠原免疫組化染色。

2 結(jié)果

2.1 分選后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

脂肪來源細(xì)胞貼壁16 h后經(jīng)流式分選，分別獲得CD204+和CD204-兩類細(xì)胞。CD204-組細(xì)胞3～4h后開始貼壁生長，24h后逐漸伸展開來，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣，5 d后達(dá)到90%融合狀態(tài)，并呈極性生長。CD204+細(xì)胞6～8 h開始貼壁生長，1～2 d伸展開來，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣，7～10 d后達(dá)到90%融合狀態(tài)（圖 1）。

圖2 脂肪來源干細(xì)胞成脂、成骨誘導(dǎo)分化（刻度：100 μm）Fig.2 ADSCs differentiation toward adipose lineage and osteogenic lineage(bar:100 μm).

圖3 細(xì)胞pellet大體觀Fig.3 Gross view of cell pellet

2.2 脂肪來源干細(xì)胞成脂、成骨分化

成脂誘導(dǎo)分化：經(jīng)流式分選后，兩組細(xì)胞形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，長梭形，成脂誘導(dǎo)分化10 d后，細(xì)胞形態(tài)明顯改變，從長梭形逐漸變圓，油紅O染色陽性，且CD204+細(xì)胞具有更強(qiáng)的成脂潛能（圖2）。

成骨誘導(dǎo)分化：CD204+和CD204-細(xì)胞被成骨誘導(dǎo)分化14 d后，茜素紅染色示成骨細(xì)胞及鈣沉積被紅染，且CD204-細(xì)胞具有更強(qiáng)的成骨潛能（圖2）。

2.3 細(xì)胞pellet大體及組織學(xué)檢測

細(xì)胞pellet大體觀：可見CD204-組形成了具有瓷白色透明軟骨樣外觀的pellet，直徑約2 mm，觸之具有一定的彈性，而CD204+組外觀微黃，觸之柔軟，直徑約1 mm（圖3）。

組織學(xué)和組織化學(xué)檢測：HE染色可見CD204-pellet組形成明顯軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，內(nèi)有細(xì)胞核，周圍有紫染的胞外基質(zhì)沉積，而CD204+pellet未形成陷窩結(jié)構(gòu)。Safranin O染色可見CD204-組具有軟骨特異性基質(zhì)染色，提示細(xì)胞外基質(zhì)中含有豐富的蛋白多糖沉積。Ⅱ型膠原免疫組化染色結(jié)果與HE相符（圖 4）。

圖4 pellet組織學(xué)檢測（標(biāo)準(zhǔn)：100 μm）Fig.4 Histological observation of cell pellets(bar:100 μm).

3 討論

脂肪來源干細(xì)胞（ADSCs）增殖能力強(qiáng)，具有向骨、軟骨、脂肪、肌肉等組織多向分化的潛能，且細(xì)胞來源豐富，取材創(chuàng)傷小，是構(gòu)建軟骨組織的良好的種子細(xì)胞。然而，ADSCs是一混雜細(xì)胞群[2-4]，包括脂肪前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等，會干擾組織工程化軟骨的構(gòu)建。近年的研究顯示，脂肪來源細(xì)胞中具有成脂、成骨、成軟骨分化潛能細(xì)胞的比例存在很大差別，其中具有成軟骨潛能的干細(xì)胞所占比例很低[5]。蔣婷等[6]應(yīng)用已知干細(xì)胞表面標(biāo)志CD105進(jìn)行流式分選，發(fā)現(xiàn)CD105+細(xì)胞比CD105-細(xì)胞具有更好的成軟骨潛能，但CD105+細(xì)胞構(gòu)建的軟骨組織均質(zhì)性仍然欠佳。因此，我們嘗試尋找與軟骨潛能密切相關(guān)的表面標(biāo)志。

前期基因芯片結(jié)果提示，CD204是ADSCs中與成軟骨潛能關(guān)系較為密切的表面標(biāo)志之一。本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用CD204作為表面標(biāo)志，對ADSCs中具有成軟骨潛能的細(xì)胞進(jìn)行分離純化，并對其干細(xì)胞特性及成軟骨能力進(jìn)行了初步探討。結(jié)果顯示，CD204-細(xì)胞比CD204+細(xì)胞具有更強(qiáng)的成軟骨能力。該結(jié)果提示我們，脂肪來源細(xì)胞中具有成軟骨潛能的干細(xì)胞主要存在于CD204-細(xì)胞中。但該結(jié)果與基因芯片分析結(jié)論大相徑庭，可能是因?yàn)閱渭?xì)胞克隆體外擴(kuò)增過程中細(xì)胞表型和特性發(fā)生較大改變。同時(shí)，CD204-細(xì)胞pellet組大體觀和組織學(xué)結(jié)果顯示pellet大部分形成了軟骨樣組織，但仍有小部分呈纖維化，提示CD204-細(xì)胞并非是一個(gè)非常均質(zhì)的細(xì)胞群體，需要開展進(jìn)一步的相關(guān)研究。

CD204是A類巨噬細(xì)胞清道夫受體蛋白，能調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、吞噬并在參與脂質(zhì)代謝、防御外界病原微生物入侵等各種生理和病理方面起重要作用[7-10]。CD204通常被認(rèn)為是M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志，常被用來區(qū)分M2型和M1型巨噬細(xì)胞。而M2型巨噬細(xì)胞被公認(rèn)為在纖維化的早期階段會釋放大量促炎癥因子和纖維調(diào)節(jié)因子，如TGF-β等，從而促進(jìn)組織纖維化的發(fā)生[13]。將CD204缺失的老鼠暴露在二氧化硅的環(huán)境中，其炎癥反應(yīng)低下，IL-1β、TNF-α、IL-6等炎癥因子產(chǎn)生減少，肺纖維化發(fā)生率下降[11－12]，這些現(xiàn)象提示CD204在炎癥的產(chǎn)生及纖維化的發(fā)生中有重要作用。另外，M2型巨噬細(xì)胞還與血管化過程和創(chuàng)傷修復(fù)過程密切相關(guān)[13,14]。同時(shí)，肥胖癥患者中，巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子（如TNF-α），能刺激脂肪細(xì)胞釋放更多的金屬基質(zhì)蛋白酶，包括MMP1、MMP3、MMP9、MMP10、MMP12 和 MMP19 等[15]。 另有研究顯示，脂肪組織中的巨噬細(xì)胞是通過脂肪前體細(xì)胞轉(zhuǎn)變而來，在脂肪組織中的多少與年齡、性別和肥胖程度等有關(guān)[12]。

綜上所述，CD204在炎癥的發(fā)生及纖維化、血管化過程及創(chuàng)傷修復(fù)過程中有重要作用，這些可能是導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)中CD204+細(xì)胞不能被誘導(dǎo)形成軟骨細(xì)胞的重要因素。通過流式分選去除約10%的CD204+細(xì)胞后，CD204-細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞的效果明顯提高，且CD204-細(xì)胞pellet能被誘導(dǎo)成較均質(zhì)的軟骨。然而，經(jīng)過分選純化后的CD204-細(xì)胞中并不是所有細(xì)胞都具有成軟骨潛能。因此，要真正將這部分細(xì)胞用于特定組織的構(gòu)建與缺損修復(fù)，還需要進(jìn)一步深入研究。

[1]Arevalo-Silva CA,Cao YL,Weng YL,et al.The effect of fibroblast growth factorand transforming growth factor-β on porcine chondrocytes and tissue-engineered autologous elastic cartilage[J].Tissue Eng,2001,7(1):81-88.

[2]Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng,2001,7(2):211-228.

[3]Yoshimura K,Shigeura T,Matsumoto D,et al.Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and uid portions of liposuction aspirates[J].Cell Physiol,2006,208(1):64-76.

[4]劉凱,呂曉杰,周廣東,等.原代脂肪基質(zhì)細(xì)胞增殖前后細(xì)胞表面標(biāo)志變化的研究[J].組織工程與重建外科,2006,2(3):128-130.

[5]張英,周廣東,楊平,等.脂肪來源細(xì)胞體外增殖規(guī)律及定向誘導(dǎo)分化研究[J].分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào),2006,39(2):152-162.

[6]Jiang T,Liu W,Lu X,et al.Potent in vitro chondrogenesis of CD105 enriched human adipose-derived stem cells[J].Biomaterials,2010,31(13):3564-3571.

[7]J zefowski S,Arredouani M,Sulahian T,et al.Disparate regulation and function of the class A scavenger receptors SR-AI/II and MARCO[J].J Immunol,2005,175(12):8032-8041.

[8]Husemann J,Loike JD,Anankov R,et al.Scavenger receptors in neurobiology and neuropathology:their Role on microglia and other cells of the nervous system[J].Glia,2002,40(2):195-205.

[9]Komohara Y,Terasaki Y,Kaikita K,et al.Clearance of apoptotic cells is not impaired in mouse embryos de-cient in class a scavenger receptor types I and II(CD204)[J].Dev Dyn,2005,232(1):67-74.

[10]Mosser DM.The many faces of macrophage activation [J].Leukoc Biol,2003,73(2):209-212.

[11]Beamer CA,Holian A.Scavenger receptor class A type I/II(CD204)null mice fail to develop fibrosis following silica exposure [J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2005,289(2):186-195.

[12]Ortega E,Xu X,Koska J,et al.Macrophage content in subcutaneous adipose tissue:associations with adiposity,age,inflammatory markers,and whole-body insulin action in healthy Pima Indians[J].Diabetes,2009,58(2):385-393.

[13]Higashi-Kuwata N,Jinin M,Makino T,et al.Characterization of monocyte/macrophage subsets in the skin and peripheral blood derived from patients with systemic sclerosis[J].Arthritis Res Ther,2010,12(4):R128.

[14]Yi H,Yu X,Gao P,et al.Pattern recognition scavenger receptor SRA/CD204 down-regulates Toll-like receptor 4 signalingdependent CD8 T-cell activation [J].Blood,2009,113(23):5819-5828.

[15]O'Hara A,LIim FL,Mazzatti DJ,et al.Microarray analysis identifies matrix metalloproteinases(MMPs)as key genes whoseexpression is up-regulated in human adipocytes by macrophage-conditioned[J].Pflugers Arch,2009,458(6):1103-1114.