鄭 波，劉清君，曾 蘇

(1.浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物分析與代謝研究室，浙江 杭州310058;2.浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院生物傳感器國家專業(yè)實驗室，浙江杭州310027)

0 引言

惡性腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其發(fā)病率近年來一直都處于逐年上升的趨勢。目前，化學(xué)藥物治療仍是腫瘤的重要治療手段。因此，如何研發(fā)出能夠有效抑制癌細(xì)胞生長增殖，或?qū)ζ渲苯泳哂袣宰饔玫念A(yù)防或治療性藥物是腫瘤防治的重要環(huán)節(jié)。隨著醫(yī)藥技術(shù)的快速發(fā)展，體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系為抗腫瘤藥物的篩選與藥效評價提供了一個有效的生物學(xué)方法。通過細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)實驗?zāi)軌蛞源双@得藥物對細(xì)胞的直接作用效果，并最終通過對培養(yǎng)細(xì)胞生長的抑制率差別，進(jìn)行藥物的篩選與評價。

近年來興起了采用微納米電子傳感器芯片對細(xì)胞或組織進(jìn)行直接測量的研究［1］?；诩?xì)胞電阻抗傳感測試的ECIS(electrical cell-substrate impedance sensor)技術(shù)，便是一種能夠同時測量多組不同細(xì)胞的電阻變化、膜電容變化，以及細(xì)胞層—基底膜空間變化的細(xì)胞生理與病理研究的細(xì)胞傳感器(cell-based biosensor)技術(shù)［2，3］。通過 μA 級的電流測量，可以實時連續(xù)地量化研究細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞增殖之間的相互作用，測量貼壁細(xì)胞遷移過程中細(xì)胞形態(tài)變化。相對于普通光學(xué)顯微鏡和熒光標(biāo)記觀察等傳統(tǒng)方法而言，這種細(xì)胞傳感器的阻抗測試使得細(xì)胞形態(tài)研究更為直觀和方便，并容易獲得實時定量的測試結(jié)果，從而已成為藥物高通量篩選研究的有效平臺［4，5］。

本研究在對細(xì)胞與電極界面阻抗檢測理論分析的基礎(chǔ)上，采用微納米電子技術(shù)制備了以交錯方式間隔排列的叉指電極陣列(interdigital electrode arrays)傳感器芯片，搭建了阻抗測試分析系統(tǒng)，以人參皂苷Rh2等抗癌藥物對人肺腺癌A549細(xì)胞模型的作用研究為例，建立了能對抗腫瘤藥物進(jìn)行實時、無損分析的細(xì)胞傳感測試技術(shù)平臺。

1 微電子傳感器原理

將細(xì)胞培養(yǎng)在一個或多個電極上，有效的電極阻抗變化能夠?qū)ε囵B(yǎng)細(xì)胞的黏附、伸展，以及遷移性進(jìn)行無損檢測。圖1是阻抗細(xì)胞傳感器的示意圖，該系統(tǒng)可用于實時定量地檢測貼壁培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞的黏附和伸展生長過程。該技術(shù)最早由曾獲得諾貝爾物理學(xué)獎的Giaever I和他的同事Keese C R在美國General Electric(GE)公司工作時發(fā)明［2，3］。他們采用哺乳動物細(xì)胞，用Au電極(2 cm2對電極和3×10－4cm2工作電極)表面進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)。用一個帶有函數(shù)發(fā)生器的鎖相放大器和一個相位敏感探測器搭建測試電路，并用電阻限制電流約為1mA，在4kHz正弦波小信號下測量細(xì)胞與基底間的阻抗，即ECIS。采用交流阻抗方法使得金屬微電極表面通過μA級的電流時，原來可以直接流經(jīng)電極表面的電極電流，由于被培養(yǎng)生長在其表面的細(xì)胞所覆蓋，而最終只能從細(xì)胞側(cè)面通過電阻間隙區(qū)域流過。

ECIS系統(tǒng)的電極都是采用面積較小的微電極作為工作電極進(jìn)行阻抗測量。小電極的缺點是細(xì)胞不容易分布在電極上，需要接種較大密度的細(xì)胞，以確保細(xì)胞能附著在電極表面，并且，小電極測量到的阻抗值只能反映一小部分細(xì)胞的狀態(tài)，容易造成不同實驗組別之間的差異。針對這些問題，基于叉指電極(interdigitated electrodes，IDEs)的細(xì)胞阻抗測量方法開始作為集成細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，用于細(xì)胞動力學(xué)的檢測。叉指電極能覆蓋傳感測試腔基底大部分的面積，因此，大大增加了有效測量細(xì)胞數(shù)目，產(chǎn)生有效阻抗。同時叉指電極也便于微型化，為其在藥物或毒素的高通量應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)［4，6］。

圖1 細(xì)胞在電極界面的阻抗分析示意圖Fig 1 Impedance analysis diagram on the electrode interface of cell

2 電極界面阻抗分析

電化學(xué)阻抗譜方法是一種常用的以小振幅的正弦波電位(或電流)為擾動信號的電化學(xué)測量方法，是一種頻率域的測量方法，以測量得到的頻率范圍很寬的阻抗譜來研究電極系統(tǒng)，因而能比其他常規(guī)的電化學(xué)方法獲得更多的動力學(xué)信息和電極界面的結(jié)構(gòu)信息。因此，在微電極阻抗測試過程中，當(dāng)對微電極施加電場時可以測量到一個基線阻抗，其主要是由電極和周邊的離子環(huán)境決定。電極電解液界面的雙電層結(jié)構(gòu)相當(dāng)于一個電容器，當(dāng)電極電位改變時，雙電層電容器即充電或放電。

當(dāng)具有貼壁性能的腫瘤細(xì)胞貼附在電極之上時，測量電極間阻抗可提供關(guān)于電極上細(xì)胞活性狀態(tài)的重要信息。當(dāng)細(xì)胞生物狀態(tài)發(fā)生變化時，系統(tǒng)可以實時并自動獲取其模擬電信號，并最終轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號以進(jìn)行進(jìn)一步的分析［4］。如圖1所示，測量所得的總阻抗包括了電極阻抗Ze，細(xì)胞與電極鈍化層之間的溶液封接阻抗Rseal，以及細(xì)胞膜電容Cm1和細(xì)胞膜離子通道阻抗Rm1。其實，封接阻抗Rseal主要產(chǎn)生于電極上細(xì)胞膜所覆蓋部分的電容和電導(dǎo)，所以，影響交流阻抗的最主要因素也就是封接阻抗Rseal，并且主要反映了細(xì)胞的生長狀態(tài)與特性。

3 傳感器芯片與系統(tǒng)

叉指電極陣列是由許多相互獨(dú)立的叉指電極單元分別與兩端的電極引線共同構(gòu)成兩對互相交錯的叉指電極區(qū)域，相鄰電極之間由絕緣材料相間隔［6］。電極芯片的加工，是在中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)所，基于標(biāo)準(zhǔn)光刻技術(shù)的微加工工藝所完成。在硅基底濺射Cr薄膜約30 nm的基礎(chǔ)上，磁控濺射約350 nm厚的Au膜作為電極材料。采用光刻、濕法腐蝕、等離子增強(qiáng)化學(xué)氣相淀積等方法，最終獲得叉指電極型生物電阻抗檢測傳感器芯片如圖2所示。其各通道是12對直徑為50μm的微電極，以交錯的方式間隔50μm排列。最后，用環(huán)氧樹脂將底部帶孔的塑料培養(yǎng)腔黏貼在PCB板上，暴露出叉指電極陣列表面，作為細(xì)胞培養(yǎng)與測試的腔體結(jié)構(gòu)，并最終配以相應(yīng)的藥物微進(jìn)樣與控制系統(tǒng)。

圖2 細(xì)胞阻抗測量系統(tǒng)的叉指電極Fig 2 Interdigitated electrodes of the cell impedance measurement system

細(xì)胞檢測時，傳感芯片通過導(dǎo)線與放在細(xì)胞培養(yǎng)箱外面的Zanium電化學(xué)工作站(德國Zahner公司)相連，并與電腦通信以實現(xiàn)數(shù)據(jù)自動采集。通過施加到芯片電極上的交流激勵，該電化學(xué)工作站能夠在10μHz～4MHz頻率范圍內(nèi)測量阻抗的幅值與相位變化，也能在固定頻率下測量阻抗幅值和相位隨時間的變化。進(jìn)行阻抗測量時采用兩電極體系，即分別與叉指電極兩端連接的工作電極和連接在一起的對電極與參比電極。

4 藥物抗腫瘤作用分析

在細(xì)胞實驗中，將人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞(浙江省中醫(yī)院腫瘤科提供)，接種于芯片叉指電極表面進(jìn)行傳代培養(yǎng)。具體的細(xì)胞固定培養(yǎng)過程，嚴(yán)格按照細(xì)胞系常規(guī)無菌培養(yǎng)方法進(jìn)行，并在顯微鏡下觀察，細(xì)胞長滿電極表面后進(jìn)行藥物分析測試實驗。在整個過程中，芯片置于在5%CO2和37℃的培養(yǎng)箱環(huán)境中。

既往的抗腫瘤藥物研究發(fā)現(xiàn)，天然藥物人參的主要有效成分人參皂苷Rh2，對肺癌細(xì)胞的體內(nèi)外生長具有顯著的抑制作用。本研究中，選用人參皂苷Rh2作為代表性藥物(浙江亞克藥業(yè)有限公司提供的人參皂苷Rh2標(biāo)準(zhǔn)品)，在1 kHz固定頻率下對3個獨(dú)立通道的芯片阻抗進(jìn)行同時監(jiān)測，并用顯微鏡觀察電極上細(xì)胞貼附和生長情況作為對照。圖3是芯片在不同濃度藥物(5，10，20μmol/L)刺激前后的阻抗變化，從中可以明顯看出在加入藥物后，阻抗大幅度地持續(xù)下降，尤其在藥物加入50～150 min內(nèi)下降最明顯，一方面驗證了測試系統(tǒng)的高效性，也得到了藥物對細(xì)胞作用的時間依賴性結(jié)果。圖4是通過顯微鏡觀察的肺腺癌細(xì)胞在人參皂苷Rh2加入前后細(xì)胞的黏附情況和細(xì)胞形態(tài)。在藥物作用前，可見大量圓形泡狀肺腺癌細(xì)胞電極表面有貼附生長，細(xì)胞在電極表面有序排列，細(xì)胞與細(xì)胞間連接精密，細(xì)胞生產(chǎn)繁殖良好，視野可見大量細(xì)胞。在藥物刺激以后，所見細(xì)胞數(shù)明顯減少，所剩細(xì)胞幾乎都從電極表面脫落，在電極間可見大量死亡細(xì)胞碎片和一些開始變型的細(xì)胞，這是細(xì)胞開始死亡的形態(tài)改變之一。

圖3 抗腫瘤藥物測試結(jié)果Fig 3 Test results of the anti-cancer drugs

圖4 電極表面的細(xì)胞觀察Fig 4 Cells observe on the electrodes

由于不同通道藥物加入前的細(xì)胞的貼附情況不同，3個通道阻抗改變的程度也不同。比較3個通道的變化，通道1在200Ω左右趨于穩(wěn)定，通道3到150Ω趨于穩(wěn)定，說明試劑對細(xì)胞的作用有一定的濃度依賴性。對通道1阻抗曲線進(jìn)行分析，在加入藥物后阻抗就開始下降，在藥物刺激的前幾分鐘，下降的速度較慢，在經(jīng)過一段時間作用之后趨于穩(wěn)定。推測這種阻抗改變規(guī)律與藥物的作用機(jī)制有一定關(guān)系。結(jié)合已發(fā)表的人參皂苷Rh2對肺腺癌A549細(xì)胞作用機(jī)制的探究，人參皂苷Rh2可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，增加機(jī)體的免疫力，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，當(dāng)其與順鉑聯(lián)用時，效果明顯高于單獨(dú)使用時對肺腺癌A549細(xì)胞的抑制率，并有一定的濃度依賴性。

隨著信息技術(shù)與生物醫(yī)藥技術(shù)的不斷結(jié)合，計算與系統(tǒng)生物學(xué)研究目標(biāo)是通過運(yùn)用計算生物學(xué)的方法，研究細(xì)胞、組織和生物整體不同水平上的各種分子及其相互作用。該研究同生物傳感器技術(shù)，尤其是能夠整體輸出功能信息的細(xì)胞傳感器技術(shù)結(jié)合，可以有效地揭示藥物作用于癌細(xì)胞的作用機(jī)理。本文利用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計中的分子對接和藥效團(tuán)模型技術(shù)，對 Bcl—2，caspase—3，F(xiàn)as，P53 等細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白與Rh2的細(xì)胞凋亡途徑進(jìn)行了研究［7］。如圖5所示，是采用Surflex-dock系統(tǒng)進(jìn)行分子對接后的Bcl-2蛋白的藥效團(tuán)模型構(gòu)建結(jié)果。從生物計算的角度對傳感器的結(jié)果進(jìn)行了驗證，并預(yù)示了將二者有效結(jié)合，用于抗腫瘤藥物分析的可行性。同時，結(jié)合本次實驗所得結(jié)果，其與用MTT比色法、流式細(xì)胞術(shù)，以及雙抗體夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附劑測定)進(jìn)行生物指標(biāo)測定得到實驗結(jié)果一致，而且其反應(yīng)濃度更低。結(jié)果顯示，細(xì)胞芯片阻抗測定的靈敏度更高，并具有良好的濃度依賴性和時間依賴性。

圖5 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl—2與Rh2的藥效團(tuán)分析結(jié)果Fig 5 Analysis results of the main target spot of the Rh2 to apoptosis-related proteins Bcl—2

5 結(jié)束語

從目前的細(xì)胞傳感器技術(shù)來看，細(xì)胞微電子傳感器平臺能夠為腫瘤細(xì)胞在不同藥物干預(yù)下的作用提供一個便捷的檢測技術(shù)手段，能夠?qū)潭ㄅ囵B(yǎng)于其表面的細(xì)胞的生理病理特性，如細(xì)胞生長、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁程度，及其與細(xì)胞外基質(zhì)分子的相互作用進(jìn)行良好的評價。所有這些細(xì)胞特性的改變，都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展極具密切關(guān)系。尤其是，如果進(jìn)一步將腫瘤患者手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本收集分離得到的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)體外給藥培養(yǎng)，通過傳感器觀察藥物對細(xì)胞的直接殺傷作用，便可以根據(jù)化療藥物系列濃度對培養(yǎng)細(xì)胞生長的抑制率差別，最終建立起一套能在臨床化療前為患者篩選敏感性藥物的檢測技術(shù)。最終客觀地針對不同個體，選擇和優(yōu)化化療藥物及其組合。

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