章松平 王 瑩 陳公英

慢性乙型肝炎患者肝損傷主要是T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用或免疫復(fù)合物的作用［1］。已有關(guān)于不同基因型患者HBeAg、HBV DNA病毒載量以及肝功能指標(biāo)等關(guān)系的研究，但不同基因分型與細(xì)胞免疫關(guān)系的報(bào)道較少［2～4］。本研究通過(guò)對(duì)175例慢性乙型肝炎患者的血清標(biāo)本進(jìn)行基因分型研究，同時(shí)檢測(cè)患者外周血T淋巴細(xì)胞及激活亞群的表達(dá)情況，旨在探討CHB患者不同基因型與細(xì)胞免疫的關(guān)系。

對(duì)象與方法

1．研究對(duì)象:收集2008年9月～2009年10月杭州市第六人民醫(yī)院住院治療的175例慢性乙型肝炎患者，男性116例，女性59例，年齡23～71歲，平均年齡45±7歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)依照2000年西安會(huì)議修訂的《病毒性肝炎防治方案》。所有患者排除甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒及其他病毒感染，入選病例予以核苷類似物(拉米夫定、恩地卡韋或替比夫定)抗病毒治療。175例慢性乙型肝炎患者中，檢測(cè)出B型基因型99例，其中HBeAg(－)46例，HBeAg(+)53例(53．5%);C型基因型76例，其中 HBeAg(－)29例，HbeAg(+)47例(61．8%)，具體分布情況見表1。不同基因分型各組的ALT、AST檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表1 175例慢性乙型肝炎患者組別情況分布

表2 175例慢性乙型肝炎患者肝功能情況分布

2．基因分型的檢測(cè):采用PCR微量板核酸雜交酶聯(lián)免疫法［5］。

3．血清HBeAg含量的檢測(cè):取肘靜脈血2ml，分離血清，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)患者HBeAg含量，HBeAg含量≤1PEIU/ml為HBeAg陰性;＞1PEIU/ml為HBeAg為陽(yáng)性。儀器為美國(guó)雅培公司生產(chǎn)的ARCHITECT i2000SR化學(xué)發(fā)光儀，試劑均為配套試劑。

4．外周血T淋巴細(xì)胞及激活亞群的表達(dá):取肘靜脈血2ml，EDTA－K2抗凝，充分混勻后送檢。取6支試管，分別加IgG1－FITC/IgG1－PE/IgG1－PC5、CD4－FITC/CD8－PE/CD3－PC5、IgG1－FITC/IgG1－PE、CD3－FITC/HLA －DR －PE、CD4－FITC/HLA －DR －PE、CD8－FITC/HLA －DR －PE熒光素標(biāo)記單克隆抗體各20μl，每管加100μl抗凝全血后混勻避光反應(yīng)15min，在Q－PREP標(biāo)本處理器(美國(guó)Beckman Coulter公司)上溶血、固定、混勻，上流式細(xì)胞儀分析 T(CD3+)細(xì)胞、CD4+(CD3+CD4+)T細(xì)胞、CD8+(CD3+CD8+)T細(xì)胞及其激活亞群(HLA－DR+CD3+/CD3+、HLADR+CD4+/CD4+和HLA－DR+CD8+/CD8+)。分析前流式細(xì)胞儀處于正常工作狀態(tài)，且應(yīng)用Flow－CheckTMFluoropheres(美國(guó)Beckman Coulter公司)檢測(cè)光路流路。同時(shí)全血標(biāo)本上CD3200血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)雅培公司)進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，得出淋巴細(xì)胞絕對(duì)值。用淋巴細(xì)胞絕對(duì)值乘以各亞群細(xì)胞百分率，得出各亞群細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。

結(jié) 果

1．CHB患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá):175例CHB患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)，見表3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析:B型HBeAg(+)組與C型HBeAg(－)組和C型HBeAg(+)組間CD8細(xì)胞百分比比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2．26和 t=2．69，P均 ＜0.05)。4組間淋巴細(xì)胞數(shù)、CD3和CD4差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 不同組別CHB患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群分布，%)

表3 不同組別CHB患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群分布，%)

基因分型 HBeAg n 淋巴細(xì)胞數(shù)CD3 CD4 CD8 B 型 － 46 1541±512 67．90±6．17 35．20±6．67 25．20±6．75+53 1682 ±540 65．8 ±10．4 37．90 ±8．38 23．80 ±5．83 C 型 － 29 1366±256 67．90±8．32 36．40±5．66 28．20±6．33+47 1703 ±509 66．9 ±11．7 34．60 ±7．27 29．90 ±7．32

2．CHB患者外周血T淋巴細(xì)胞激活亞群的表達(dá):175例CHB患者外周血T淋巴細(xì)胞激活亞群的表達(dá)，見表4。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，4組間T淋巴細(xì)胞激活亞群(CD3+HLA－DR+、CD4+HLA－DR+和CD8+HLA－DR+)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 不同組別CHB患者外周血T淋巴細(xì)胞激活亞群的分布，%)

表4 不同組別CHB患者外周血T淋巴細(xì)胞激活亞群的分布，%)

基因分型 HBeAg n CD3+HLADR+ CD4+HLADR+ CD8+HLADR+ HLADR +B 型 － 46 5．78 ±3．06 2．57 ±1．64 3．07 ±1．34 21．80 ±6．91 53 4．95 ±2．58 2．45 ±1．51 2．52 ±1．75 19．80 ±7．92 C 型 － 29 5．10 ±2．49 3．01 ±1．26 2．64 ±1．73 19．70 ±5．01+47 5．69 ±3．27 3．29 ±1．21 2．43 ±1．41 18．00 ±7．88+

討 論

HBV基因型有一定的地理分布特征，在我國(guó)主要以B型和C型最為常見，不同的基因分型與臨床病情輕重存在一定的關(guān)系，但與機(jī)體的細(xì)胞免疫的相關(guān)性報(bào)道較少［2，6］。本文通過(guò)對(duì)175例慢性乙型肝炎患者不同基因分型時(shí)其外周血T淋巴細(xì)胞及激活亞群檢測(cè)，結(jié)果顯示:B基因型HBeAg(+)組與C基因型HBeAg(－)組和C基因型HBeAg(+)組間CD8細(xì)胞百分比有顯著性差異，C型基因型患者CD8細(xì)胞高于B型基因型。而各組間CD3、CD4百分比結(jié)果比較均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。王敏等［7］動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)慢性乙型肝炎患者抗病毒治療前后外周血CD8淋巴細(xì)胞有升高趨勢(shì)。有報(bào)道［3］基因型和炎癥程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但和纖維化程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即基因型C型的纖維化程度比基因型B型的纖維化程度重。提示基因C型比基因B型肝臟組織學(xué)易發(fā)生纖維組織增生。但HBeAg陰性組和陽(yáng)性組肝臟病理組織炎癥活動(dòng)度無(wú)明顯差異［8］。鄒懷賓等［4］研究發(fā)現(xiàn)，基因B和C型對(duì)拉米夫定抗病毒治療的療效無(wú)影響，基因B型對(duì)干擾素α治療的療效優(yōu)于C型。這其中是否具有關(guān)聯(lián)性還有待進(jìn)一步的探討。

對(duì)175例CHB患者依據(jù)B和C基因型分組比較外周血T淋巴細(xì)胞激活亞群差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，先前研究顯示［9］，CHB患者外周血T淋巴細(xì)胞HLADR抗原表達(dá)與不同含量HBV DNA和HBeAg間存在一定的關(guān)聯(lián)性。本研究結(jié)果顯示CHB患者中基因分型對(duì)T淋巴細(xì)胞激活狀態(tài)無(wú)明顯影響。

綜上所述，慢性乙型肝炎患者基因分型與外周血CD8細(xì)胞存在一定的關(guān)系，但由于本研究本例數(shù)較少，且未進(jìn)行抗病毒治療前后的對(duì)比，因此有待進(jìn)一步的深入研究。

1 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)．慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)［J］．中華臨床感染病雜志，2010，4(1):1－13

2 許軍，王齊欣，蔣棟，等．乙型肝炎病毒基因型與病情輕重的關(guān)系［J］．中華肝臟病雜志，2003，13(4):228 －229

3 許家璋，謝琴秀，李平，等．乙型肝炎病毒的基因型和臨床病理特征的分析［J］．中華傳染病雜志，2006，24(4):270 －272

4 鄒懷賓，朱理珉，趙桂鳴，等．e抗原陽(yáng)性慢性乙肝肝炎患者感染病毒的基因型與抗病毒治療療效的關(guān)系［J］．中華肝臟病雜志，2007，15(6):425－427

5 陳公英，邵俊斌，徐岱，等．浙江省乙型肝炎病毒B、C基因型感染者臨床和肝組織病理的比較［J］．中華傳染病雜志，2006，24(2):113－115

6 夏國(guó)良，Omana V，賈志遠(yuǎn)，等．乙型肝炎病毒基因型和血清型在我國(guó)部分地區(qū)的分布及其特點(diǎn)［J］．中華流行病學(xué)雜志，2001，22(5):348－351

7 王敏，張玲霞，羅生強(qiáng)，等．慢性乙型肝炎患者抗病毒治療前后HBV特異性T細(xì)胞反應(yīng)［J］．中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2005，19(4):387－390

8 歐曉娟，王曉明，王寶恩，等．e抗原陽(yáng)性及陰性慢性乙型肝炎患者臨床特點(diǎn)比較［J］．中華肝臟病雜志，2007，15(6):428 －430

9 章松平，張永樂，朱明利，等．慢性乙型肝炎T淋巴細(xì)胞HLA－DR抗原表達(dá)與HBV DNA和HBeAg含量關(guān)系的初步分析［J］．中華臨床感染病雜志，2010，3(6):333 －336