蔣 平 唐湘蓮 韓紹偉

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是表達(dá)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3(Fork－h(huán)ead box P3)、CD25(IL－2Rα)、CTLA－4和GITR等的CD4+T細(xì)胞亞群，其中Foxp3是Treg細(xì)胞發(fā)育和行使功能的關(guān)鍵分子［1，2］。1995 年 Sakaguchi等［3］發(fā)現(xiàn) Treg細(xì)胞在機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)維持、腫瘤免疫及移植耐受等方面發(fā)揮著重要的作用，但在腫瘤免疫中卻通過與效應(yīng)T細(xì)胞的接觸抑制或分泌細(xì)胞因子抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，其數(shù)量和功能的異常可能對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重影響。近年來的研究主要集中于Treg細(xì)胞發(fā)揮腫瘤免疫抑制作用的具體機(jī)制，而關(guān)于化療對(duì)Treg細(xì)胞數(shù)量及功能的影響研究較少，只有少數(shù)研究局限在單個(gè)化療藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或血液病患者的作用上，個(gè)別應(yīng)用在臨床晚期實(shí)體瘤上［4～10］。本研究以臨床胃癌術(shù)后患者為對(duì)象，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)和RT－PCR技術(shù)，觀察FOLFOX方案化療對(duì)患者免疫系統(tǒng)中Treg細(xì)胞數(shù)量和功能及FoxP3 mRNA表達(dá)情況的影響。

材料與方法

1．臨床資料:病例選自2009年1～12月間在筆者醫(yī)院普外科住院的確診胃癌患者，共43例，包括乳頭狀腺癌20例，管狀腺癌13例，黏液腺癌8例，印戒細(xì)胞癌2例;TNM分期Ⅰ期8例，Ⅱ期21例，Ⅲ期12例，Ⅳ期2例;其中男性27例，女性16例，年齡38～70歲，平均年齡58．9歲，均為行D2胃癌根治術(shù)術(shù)后，所有研究對(duì)象近期內(nèi)均無急、慢性感染、HIV及病毒性肝炎并且未使用過免疫抑制劑，無自身免疫性疾病史。所有患者均予FOLFOX方案(第1天奧沙利鉑130mg/m2+第1～5天5－FU 400mg/m2+第1～5天 CF 200mg/m2化療，每3周為1個(gè)周期。

2．標(biāo)本采集:所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象于第1次化療前1天，化療結(jié)束后第5天清晨空腹外周血。

3．主要試劑:異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人CD4和藻紅熒光素(PE)標(biāo)記的鼠抗人 CD25抗體(Biolegend)，F(xiàn) ITC標(biāo)記小鼠 IgG同型對(duì)照及 PE標(biāo)記小鼠IgG同型對(duì)照。淋巴細(xì)胞分離液(Sigma公司)。CD4+CD 25+regulatory T cell isolation kit(Miltenyi Biotec公司)、單克隆抗人 CD28抗體(R＆D公司)、LEAF純化抗人CD3抗體(Biolegend公司)、重組人IL－2(Peprotech EC公司)、［甲基－3－H］胸腺嘧啶核苷(3H－TdR)(中國(guó)科學(xué)院上海核技術(shù)開發(fā)公司)。

4．流式細(xì)胞法檢測(cè)外周血Treg含量:每個(gè)樣本取100μl抗凝血和20μl CD4(FITC)/CD25(PE)標(biāo)記抗體加入流式管混勻，室溫避光孵育30min;加入紅細(xì)胞裂解液2ml振蕩混勻后避光放置10min至液體透亮;1200g離心5min，2ml PBS重懸后洗滌1遍;再加入0．5ml PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)(BD公司，F(xiàn)ACSCalibur檢測(cè))，Cellquest軟件數(shù)據(jù)分析，記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

5．免疫磁珠分選法(MACS)分離 Treg細(xì)胞:取外周血20ml，利用密度梯度離心法，獲取PBMCs，利用CD4+CD 25+T細(xì)胞磁珠分離試劑盒(Miltenyi Biotec公司)分離細(xì)胞，先陰性分選獲得CD4+T細(xì)胞;再用PE標(biāo)記抗小鼠CD25單克隆抗體，并以磁珠標(biāo)記抗PE抗體，經(jīng)陽(yáng)性分選獲得CD4+CD25+T細(xì)胞，陰性分選獲得CD4+CD25－T細(xì)胞;通過FACS(BD公司，F(xiàn)ACSCalibur)分析細(xì)胞純度。

6．RT－PCR法檢測(cè)Treg細(xì)胞表面標(biāo)志Foxp3 mRNA的表達(dá)情況:采取Trizol法提取和純化各樣本細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定純度、濃度并定量。取2μg總 RNA，按照RT試劑盒說明書進(jìn)行RT操作程序合成cDNA，然后PCR擴(kuò)增Foxp3，以 GAPDH為內(nèi)參照。FoxP3引物上游:5'－GCTGGTCGGGAGAAGAGGA－AAA －3'，下游:5'－CA GTATCCCACGGAAATAACCT－3'，擴(kuò)增片段大小為433bp;GAPDH引物上游:5'－ATCCCATCACCATCTTCCAG －3'，下游:5'－GAGTCCTTC－CACGATACCAA－3'，擴(kuò)增片段大小為308bp，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min，以94℃變性35s，52℃退火40s，72℃延伸 55s為一個(gè)循環(huán)，共 35個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)掃描保存圖像，采用Quantity One 4．6．2(BIO－RAD)分析軟件，對(duì)電泳條帶的光密度進(jìn)行分析，測(cè)定各條帶的灰度值，通過與內(nèi)參照的比較計(jì)算各樣本Foxp3的相對(duì)mRNA表達(dá)豐度。

7．3H－TdR摻入法檢測(cè)Treg細(xì)胞體外抑制CD4+CD25－T細(xì)胞增殖的能力:用小鼠抗人CD3單抗(5μg/ml)包被96孔板，200μl每孔，4℃過夜，PBS洗3遍，然后每孔各加入新鮮分離的Treg細(xì)胞及CD4+CD25－T細(xì)胞，每組細(xì)胞總數(shù)1×105個(gè)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)分3組:①單純Treg細(xì)胞組;②Treg細(xì)胞:CD4+CD25－T細(xì)胞 =1∶1混合培養(yǎng)組;③單純CD4+CD25－T細(xì)胞組。加入小鼠抗人 CD28單抗 (5μg/ml)及10%FCS RPM I－1640作為培養(yǎng)基，每孔終體積 200μl。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。終止培養(yǎng)前16h，每孔加入最終放射活性為1μCi/孔的3H－TdR(50μl)后繼續(xù)培養(yǎng)，收集細(xì)胞至玻璃纖維濾紙上，37℃孵箱烤干后予液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)量，記錄每分鐘放射計(jì)數(shù)(CPM)，計(jì)算得到抑制率，公式為:抑制率=(l－混合培養(yǎng)組CPM值/單純CD4+CD25－T細(xì)胞培養(yǎng)組CPM值)×100%。

8．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，主要采用單因素方差分析和LSD－t檢驗(yàn)進(jìn)行樣本均數(shù)間兩兩比較，p＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．患者外周血中 Treg細(xì)胞的水平:FACS結(jié)果示:43胃癌患者化療前外周血中Treg細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例為7．57% ±2．91%，占CD4+T細(xì)胞的比例為17．63% ±6．31%，化療后患者Treg細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例下降至5．21% ±1．69%，占CD4+T細(xì)胞的比例下降至13．79% ±4．82%，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．01)，可見化療后淋巴細(xì)胞的減少以Treg細(xì)胞尤為顯著，導(dǎo)致Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例下降，詳見表1。

表1 患者化療前后外周血Treg細(xì)胞水平(%，n=43)

2．MACS分離后Treg細(xì)胞及CD4+CD25－T細(xì)胞純度:FACS結(jié)果顯示:MACS法分離各樣本Treg細(xì)胞及CD4+CD25－T細(xì)胞純度均＞97．5%，化療前后各細(xì)胞純度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)無明顯影響(P ＞0．01)，詳見表2。

表2 患者化療前后外周血Treg細(xì)胞水平(%，n=43)

3．FoxP3 mRNA在外周血Treg細(xì)胞中的表達(dá):RT－PCR結(jié)果顯示:32例患者化療前外周血Treg細(xì)胞中 FoxP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平為 87．32% ±17.24%，化療后其相對(duì)表達(dá)水平下降為58．78% ±13．12%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．01)，詳見圖1。

4．Treg細(xì)胞對(duì)CD4+CD25－T細(xì)胞增殖的抑制作用:3H－TdR摻入法檢測(cè)各樣本細(xì)胞的增殖情況后結(jié)果顯示:①化療后Treg細(xì)胞的增殖活性較化療前明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．05);②純化的Treg細(xì)胞可以降低CD4+CD25－T細(xì)胞的增殖能力，化療后其免疫抑制功能較化療前減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．01)，見圖2、圖3。

圖1 患者化療前后外周血Treg細(xì)胞水平FoxP3 mRNA表達(dá)情況(n=4)

討 論

近年來惡性腫瘤患者機(jī)體內(nèi)在的抗腫瘤免疫能力日益受到關(guān)注，當(dāng)前臨床胃癌治療的研究熱點(diǎn)已提升到患者免疫功能的改變及其抗腫瘤機(jī)制的研究上。臨床胃癌常規(guī)治療方法包括根治性切除、化療等，這些治療手段同時(shí)也可能造成胃癌患者免疫功能的改變。因此通過提高胃癌患者免疫力改善胃癌患者預(yù)后從而提高胃癌患者生存質(zhì)量還值得我們進(jìn)一步的研究。

Treg細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，與腫瘤的免疫功能抑制密切相關(guān)，它們?cè)谀[瘤微環(huán)境中抑制性調(diào)節(jié)CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化與增殖，抑制免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，降低了腫瘤疫苗或腫瘤抗原多肽激活的樹突狀細(xì)胞所引起的腫瘤免疫反應(yīng)，從而達(dá)到免疫的負(fù)性調(diào)節(jié)作用［11］?；熥鳛槲赴┬g(shù)后的重要治療手段，在一定程度上可以減少術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、改善生活質(zhì)量并延長(zhǎng)患者生存期，但化療也可能導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的下降。本研究將觀察FOLFOX方案化療對(duì)胃癌患者免疫系統(tǒng)中Treg細(xì)胞數(shù)量和功能的影響，有助于進(jìn)一步探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在腫瘤免疫耐受中的作用，以及提高腫瘤免疫治療的效果。

通過流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)FOLFOX方案化療前后胃癌患者外周血中CD4+T細(xì)胞、Treg細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用FOLFOX方案化療5天后患者外周血CD4+T細(xì)胞、Treg細(xì)胞占外周血單核細(xì)胞的比例明顯減少，且Treg細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞顯著下降，提示FOLFOX方案化療可降低Treg細(xì)胞數(shù)量。既往有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［4，5］表明，小鼠體內(nèi)注射化療藥物環(huán)磷酰胺后，Treg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量及其占CD4+T細(xì)胞百分率比其他淋巴細(xì)胞亞群顯著減少、凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加。在臨床試驗(yàn)方面，Ghiringhelli等［10］對(duì)9個(gè)發(fā)生轉(zhuǎn)移的實(shí)體腫瘤患者低劑量反復(fù)給予環(huán)磷酰胺后，Treg細(xì)胞發(fā)生明顯的選擇性的減少，除環(huán)磷酰胺外，蒽環(huán)類藥物多西紫杉醇，阿糖胞苷類藥物氟達(dá)拉濱對(duì)Treg也起抑制作用［6，7］。這些研究均說明化療導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞減少狀態(tài)下更多地殺傷Treg細(xì)胞，導(dǎo)致Treg細(xì)胞比例下降，從而使抑制免疫應(yīng)答的因素減少，有利于誘生抗腫瘤免疫效應(yīng)。

Foxp3基因又稱叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子，Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)和作用發(fā)揮需要Foxp3基因的穩(wěn)定持續(xù)和高水平表達(dá)［1，2］。研究表明胃癌患者的外周血Treg細(xì)胞中 FoxP3 mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)，表明在胃癌的發(fā)展過程中，轉(zhuǎn)錄因子FoxP3能夠通過某種機(jī)制調(diào)控誘導(dǎo)了患者外周血Treg細(xì)胞的增殖，并且增強(qiáng)了Treg細(xì)胞對(duì)自身免疫系統(tǒng)的抑制功能，從而參與機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受［12］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在化療前胃癌患者的外周血Treg細(xì)胞中FoxP3 mRNA呈現(xiàn)較高表達(dá)，應(yīng)用FOLFOX方案化療5天后患者FoxP3 mRNA表達(dá)水平顯著下降，初步說明FOLFOX化療方案在減少Treg細(xì)胞數(shù)量的同時(shí)可下調(diào)其表面標(biāo)志物FoxP3基因的表達(dá)水平，從而可能減弱Treg細(xì)胞的免疫抑制功能。Lutsiak、Brode 等［4，5］研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物環(huán)磷酰胺顯著減少Treg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量的同時(shí)可下調(diào)Foxp3的表達(dá)量，從而削弱Treg細(xì)胞的功能使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。

Treg細(xì)胞免疫抑制性表現(xiàn)在經(jīng)TCR介導(dǎo)的信號(hào)刺激活化后能夠抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖。最初Woo等［13］研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞可以抑制CD4+CD25－T細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)在分離純化Treg細(xì)胞和CD4+CD25－T細(xì)胞后將其共同溫育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用FOLFOX方案化療5天后患者外周血Treg細(xì)胞自身增殖活性較化療前顯著下降，且Treg細(xì)胞對(duì)CD4+CD25－T細(xì)胞的增殖抑制作用顯著減弱，表明Treg細(xì)胞的免疫抑制功能減弱。此外，Lutsiak、Brode等［4，5］動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明環(huán)磷酰胺可致Treg細(xì)胞體外抑制 CD4+CD25－T 細(xì)胞增殖能力下降，Beyer等［7］檢測(cè)73例接受氟達(dá)拉濱化療方案的B細(xì)胞慢性淋巴性白血病患者化療前、后(化療后第7天)的外周血，結(jié)果顯示化療后，Treg細(xì)胞數(shù)目明顯減少，Treg細(xì)胞抑制功能減弱甚至消失。

化療作為一種重要的治療腫瘤的手段，對(duì)Treg細(xì)胞產(chǎn)生的影響尚無統(tǒng)一的意見。本實(shí)驗(yàn)初步表明FOLFOX方案化療可下調(diào)Treg細(xì)胞數(shù)量且可減弱其免疫抑制功能，從而增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)，為腫瘤的化療免疫治療提供了一種新的思路。目前，關(guān)于各種化療藥物對(duì)Treg細(xì)胞的影響以及化療藥物在第幾個(gè)周期后發(fā)揮明顯作用的研究還不多，對(duì)于各種化療藥物對(duì)Treg細(xì)胞作用的機(jī)制更知之甚少，還有待于進(jìn)一步研究。

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