陳 健 仇 容 畢艷麗 徐麟皓 沈香娣

缺氧是實(shí)體腫瘤的主要生長特性之一，與腫瘤的凋亡抑制、放化療耐受、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切［1］。也有研究表明缺氧可以通過抑制線粒體呼吸鏈、降低線粒體膜電位，增加活性氧的生成以及通過JNK/SAPK等信號途徑誘導(dǎo)凋亡［2］。本實(shí)驗(yàn)從缺氧對人非小細(xì)胞肺癌A549體外毒性試驗(yàn)，并對細(xì)胞傳導(dǎo)通路的相關(guān)分子進(jìn)行研究，探討缺氧誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

材料與方法

1．細(xì)胞來源和培養(yǎng):人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。細(xì)胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有10%小牛血清的RPMI1640，每2～3天傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2．藥物和試劑:二氯化鈷(CoCl2)購自美國 Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)液購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;小牛血清購自杭州四季青生物制品公司;MTT、DMSO均為美國MBI公司產(chǎn)品;熒光染色試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;一抗(survivin、Akt和p－Akt抗體購自美國CST公司;β－actin購自美國 Santa Cruz公司)，二抗(survivin、Akt、p－Akt和β－actin均購自美國Pierce公司)。

3．MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率:用培養(yǎng)液稀釋配成不同濃度 CoCl2(100、200、300、400μmol/L)。以約 2．0 ×104個/孔細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后棄去舊培養(yǎng)液，分別加入不同濃度CoCl2，每個濃度每個時間點(diǎn)均設(shè)6個平行孔，并設(shè)細(xì)胞對照組，細(xì)胞對照組加入無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24、36和48h。采用MTT法檢測，棄去培養(yǎng)液，加入5g/L的MTT溶液20微升/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后吸棄上清液，加150微升/孔DMSO，振蕩10min后用酶標(biāo)儀測每孔A490nm值，計算細(xì)胞生長抑制率(IR)。細(xì)胞生長抑制率=［1－(A藥物處理組/A細(xì)胞對照組)］×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

4．AO/EB熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡:以約1．0×106個/孔細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待貼壁后棄去舊培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的CoCl2(200、300、400μmol/L)，并設(shè)細(xì)胞對照組，培養(yǎng)24、48h，用PBS洗滌并配成5．0×105個/ml細(xì)胞懸液，將25μl細(xì)胞懸液和染色反應(yīng)液混合，吸取10μl混合液置于一載玻片，并用蓋玻片蓋上，在熒光顯微鏡510nm激發(fā)波長下觀察細(xì)胞。計數(shù)500個細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=［(凋亡早期細(xì)胞+凋亡晚期細(xì)胞)/細(xì)胞總數(shù)］×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

5．Western blotting檢測蛋白表達(dá):實(shí)驗(yàn)組分別用不同濃度(200、300、400μmol/L)CoCl2培養(yǎng) 24h 及 300μmol/L CoCl2作用24、36、48h，并設(shè)細(xì)胞對照組，收集各組細(xì)胞。PBS洗滌2次，加入蛋白裂解液，置冰上30～60min。12000r/min離心15min，取上清液，采用BCA法進(jìn)行總蛋白定量，然后上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗，4℃孵育過夜，TBS－T洗膜3次，二抗孵育2h，洗膜3次，加入ECL，暗盒中曝光后進(jìn)行顯影和定影。應(yīng)用凝膠掃描儀對膠片進(jìn)行光密度掃描，并以β－actin校正做相對量分析，數(shù)值以兩者積分光密度的比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

結(jié) 果

1．細(xì)胞增殖的檢測結(jié)果:300、400μmol/L CoCl2作用24、36、48h后A549細(xì)胞的生長受到不同程度的抑制，與對照組比較有顯著差異(p＜0．01)，并呈比較明顯的劑量和時間依賴關(guān)系，400μmol/L 48h后細(xì)胞抑制率可達(dá)79．03%(表1)。

表1 不同濃度CoCl2作用不同時間對細(xì)胞生長的影響，n=3)

與對照組比較，*P ＜0．01，＊＊P ＜0．001

組別 24h A490值 IR(%) 36h A490值 IR(%) 48h A490值 IR(%)0．62 ±0．03 － 0．60 ±0．03 － 0．62 ±0．06 －2(100μmol/L) 0．73 ±0．07 －17．74 0．76 ±0．05 －26．67 0．56 ±0．05 9．68 3(200μmol/L) 0．61 ±0．04 1．61 0．55 ±0．09 8．33 0．42 ±0．02* 32．26 4(300μmol/L) 0．38 ±0．01＊＊ 38．71 0．38 ±0．01* 36．67 0．32 ±0．06＊＊ 48．39 5(400μmol/L) 0．31 ±0．02＊＊ 50．00 0．22 ±0．06＊＊ 63．33 0．13 ±0．05＊＊1(對照組)79．03

2．凋亡細(xì)胞的檢測結(jié)果:通過熒光顯微鏡下觀察到凋亡早期細(xì)胞形狀不規(guī)則，如呈新月形，核質(zhì)體呈綠色;凋亡晚期細(xì)胞大小不一，可見胞質(zhì)芽狀突起，核質(zhì)體呈橙色，染色質(zhì)濃縮，見圖 1。200、300、400μmol/L CoCl2處理24、48h后的細(xì)胞凋亡率均顯著高于對照組(p＜0．01)(表2)。

表2 不同濃度CoCl2作用不同時間對細(xì)胞凋亡的影響(n=3

表2 不同濃度CoCl2作用不同時間對細(xì)胞凋亡的影響(n=3

與對照組比較，*P ＜0．01，＊＊P ＜0．001

組別 組別(μmol/L)細(xì)胞凋亡率(%)(24h)細(xì)胞凋亡率(%)(48h)2．23 ±0．41 2．55 ±0．48 CoCl2 組 200 9．34 ±0．87* 12．13 ±1．61＊＊300 12．93 ±1．50＊＊ 21．25 ±3．52＊＊400 19．17 ±2．93＊＊ 26．09 ±1．80對照組 －＊＊

3．total－Akt、p－Akt及 survivin 蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果:300、400μmol/L CoCl2作用 48h 后 p －Akt、survivin蛋白表達(dá)量較對照組顯著減少(p＜0．01)，300μmol/L CoCl2作用36、48h較對照組能顯著下調(diào)p－Akt、survivin蛋白表達(dá)量(P ＜0．01)，而 total－Akt蛋白表達(dá)量均無顯著變化。結(jié)果見圖2、圖3，表3、表4。

圖2 不同濃度CoCl2作用48h后total－Akt、p－Akt及survivin蛋白表達(dá)

表3 不同濃度CoCl2作用48h后total－Akt、p－Akt及survivin蛋白表達(dá)(n=3)

表3 不同濃度CoCl2作用48h后total－Akt、p－Akt及survivin蛋白表達(dá)(n=3)

與對照組比較，*P ＜0．01，＊＊P ＜0．001

－ 0．20 ±0．01 0．39 ±0．03 0．46 ±0．03 CoCl2 組 200 0．22 ±0．02 0．38 ±0．02 0．40 ±0．02 300 0．20 ±0．03 0．28 ±0．01* 0．30 ±0．03＊＊400 0．19 ±0．02 0．14 ±0．03＊＊0．11 ±0．03 total－Akt p－Akt survivin對照組組別(μmol/L)＊＊

圖3 400μmol/L CoCl2作用不同時間后total－Akt、p－Akt及survivin蛋白表達(dá)

表4 400μmol/L CoCl2作用不同時間后total－Akt、p－Akt及survivin蛋白表達(dá)(n=3

表4 400μmol/L CoCl2作用不同時間后total－Akt、p－Akt及survivin蛋白表達(dá)(n=3

與對照組比較，*P ＜0．01，＊＊P ＜0．001

－ 0．21 ±0．03 0．37 ±0．04 0．38 ±0．03 CoCl2 組 24h 0．22 ±0．05 0．26 ±0．02* 0．34 ±0．03 36h 0．20 ±0．02 0．20 ±0．03＊＊ 0．22 ±0．02＊＊48h 0．17 ±0．04 0．15 ±0．02＊＊ 0．15 ±0．02 Total－Akt p－Akt survivin對照組分組＊＊

討 論

正常氧供給條件下，鈷通過細(xì)胞內(nèi)離子置換使亞鐵螯合酶失活，抑制細(xì)胞氧化反應(yīng)，從而達(dá)到常氧下模擬細(xì)胞缺氧的目的。我們采用CoCl2處理A549細(xì)胞，模擬體外細(xì)胞化學(xué)性缺氧進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用MTT法和細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測證實(shí)CoCl2對A549細(xì)胞具有明顯的毒性作用，且呈劑量－時間依賴性地增加細(xì)胞生長抑制率并誘導(dǎo)其凋亡，400μmol/L作用48h細(xì)胞生長抑制率高達(dá)79%，細(xì)胞凋亡率高達(dá)26%。

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它處在多條信號通路的重要交叉點(diǎn)，在細(xì)胞的存活和介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生中有重要作用，并且已經(jīng)成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)之一［3］。p－Akt是AKT的功能活化狀態(tài)，在大部分腫瘤中高表達(dá)，其活化過程可分為PI3K依賴和非PI3K依賴兩種。磷脂酰肌醇－3激酶(PI3K)是細(xì)胞內(nèi)磷脂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，Akt處在PI3K/Akt信號通路的中心環(huán)節(jié)，是PI3K下游的直接靶蛋白，Akt催化結(jié)構(gòu)域的Thr308及Ser473位點(diǎn)的磷酸化而被激活，成為p－Akt［4］，只有 p－AKT 才具有生物學(xué)特性。本實(shí)驗(yàn)Western blotting法檢測了CoCl2處理前后的Akt、p－Akt蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示p－AkT蛋白表達(dá)量比對照組下降，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異，且呈劑量－時間依賴性，而總AKT蛋白改變無顯著性差異，說明p－AkT是細(xì)胞內(nèi)早反應(yīng)事件，證實(shí)該信號通路被化學(xué)性缺氧阻斷。p－AkT抑制細(xì)胞凋亡與其能夠磷酸化激活下游一系列分子如Bcl－2家族、Foxo家族、lAPs家族、半胱氨酸蛋白酶(caspase)－3、caspase－9、Bad、NF － κB 等成員有關(guān)，保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生凋亡［5～8］。

經(jīng)典的凋亡通路有死亡受體通路和線粒體通路，最后都激活天冬氨酸特異性caspase家族導(dǎo)致凋亡的發(fā)生，而凋亡抑制蛋白(IAPs)家族起抑制凋亡的作用［9］。survivin是IAPs家族的一個新成員，是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子。研究證實(shí)，它在肺癌組織中表達(dá)高達(dá)90%，并且是非小細(xì)胞肺癌最顯著的預(yù)后影響因子之一［10］。survivin的高表達(dá)可抑制 Fas、Bax、caspase以及抗腫瘤藥物等多種因素所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，CoCl2處理后的survivin蛋白表達(dá)水平顯著下降，并呈劑量－時間依賴性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而且本研究也探討了p－Akt和survivin的關(guān)系，結(jié)果表明p－Akt和 survivin表達(dá)呈正相關(guān)，提示在A549細(xì)胞中survivin的高表達(dá)可能與Akt的活化有關(guān)。Fornaro等在前列腺癌細(xì)胞及CD34+的臍血細(xì)胞中也證實(shí)了存在Akt/survivin通路。

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可證實(shí)，CoCl2誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡與阻斷Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，下調(diào)survivin表達(dá)發(fā)病機(jī)制占有重要地位，但細(xì)胞凋亡過程是多系統(tǒng)、多因素參與的復(fù)雜過程，是否還有其他機(jī)制的參與，具體的機(jī)制尚有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

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