陳 健 仇 容 畢艷麗 徐麟皓 沈香娣
缺氧是實體腫瘤的主要生長特性之一,與腫瘤的凋亡抑制、放化療耐受、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切[1]。也有研究表明缺氧可以通過抑制線粒體呼吸鏈、降低線粒體膜電位,增加活性氧的生成以及通過JNK/SAPK等信號途徑誘導(dǎo)凋亡[2]。本實驗從缺氧對人非小細胞肺癌A549體外毒性試驗,并對細胞傳導(dǎo)通路的相關(guān)分子進行研究,探討缺氧誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡的分子機制。
1.細胞來源和培養(yǎng):人非小細胞肺癌A549細胞購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。細胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),培養(yǎng)液為含有10%小牛血清的RPMI1640,每2~3天傳代1次,取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。
2.藥物和試劑:二氯化鈷(CoCl2)購自美國 Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)液購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;小牛血清購自杭州四季青生物制品公司;MTT、DMSO均為美國MBI公司產(chǎn)品;熒光染色試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;一抗(survivin、Akt和p-Akt抗體購自美國CST公司;β-actin購自美國 Santa Cruz公司),二抗(survivin、Akt、p-Akt和β-actin均購自美國Pierce公司)。
3.MTT法檢測細胞生長抑制率:用培養(yǎng)液稀釋配成不同濃度 CoCl2(100、200、300、400μmol/L)。以約 2.0 ×104個/孔細胞接種于96孔培養(yǎng)板中,待細胞貼壁后棄去舊培養(yǎng)液,分別加入不同濃度CoCl2,每個濃度每個時間點均設(shè)6個平行孔,并設(shè)細胞對照組,細胞對照組加入無血清培養(yǎng)液,培養(yǎng)24、36和48h。采用MTT法檢測,棄去培養(yǎng)液,加入5g/L的MTT溶液20微升/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4h,然后吸棄上清液,加150微升/孔DMSO,振蕩10min后用酶標儀測每孔A490nm值,計算細胞生長抑制率(IR)。細胞生長抑制率=[1-(A藥物處理組/A細胞對照組)]×100%。實驗重復(fù)3次,取平均值。
4.AO/EB熒光染色法檢測細胞凋亡:以約1.0×106個/孔細胞接種于6孔培養(yǎng)板中,待貼壁后棄去舊培養(yǎng)液,分別加入不同濃度的CoCl2(200、300、400μmol/L),并設(shè)細胞對照組,培養(yǎng)24、48h,用PBS洗滌并配成5.0×105個/ml細胞懸液,將25μl細胞懸液和染色反應(yīng)液混合,吸取10μl混合液置于一載玻片,并用蓋玻片蓋上,在熒光顯微鏡510nm激發(fā)波長下觀察細胞。計數(shù)500個細胞,計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=[(凋亡早期細胞+凋亡晚期細胞)/細胞總數(shù)]×100%。實驗重復(fù)3次,取平均值。
5.Western blotting檢測蛋白表達:實驗組分別用不同濃度(200、300、400μmol/L)CoCl2培養(yǎng) 24h 及 300μmol/L CoCl2作用24、36、48h,并設(shè)細胞對照組,收集各組細胞。PBS洗滌2次,加入蛋白裂解液,置冰上30~60min。12000r/min離心15min,取上清液,采用BCA法進行總蛋白定量,然后上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,加一抗,4℃孵育過夜,TBS-T洗膜3次,二抗孵育2h,洗膜3次,加入ECL,暗盒中曝光后進行顯影和定影。應(yīng)用凝膠掃描儀對膠片進行光密度掃描,并以β-actin校正做相對量分析,數(shù)值以兩者積分光密度的比值表示。實驗重復(fù)3次,取平均值。
1.細胞增殖的檢測結(jié)果:300、400μmol/L CoCl2作用24、36、48h后A549細胞的生長受到不同程度的抑制,與對照組比較有顯著差異(p<0.01),并呈比較明顯的劑量和時間依賴關(guān)系,400μmol/L 48h后細胞抑制率可達79.03%(表1)。
表1 不同濃度CoCl2作用不同時間對細胞生長的影響,n=3)
與對照組比較,*P <0.01,**P <0.001
組別 24h A490值 IR(%) 36h A490值 IR(%) 48h A490值 IR(%)0.62 ±0.03 - 0.60 ±0.03 - 0.62 ±0.06 -2(100μmol/L) 0.73 ±0.07 -17.74 0.76 ±0.05 -26.67 0.56 ±0.05 9.68 3(200μmol/L) 0.61 ±0.04 1.61 0.55 ±0.09 8.33 0.42 ±0.02* 32.26 4(300μmol/L) 0.38 ±0.01** 38.71 0.38 ±0.01* 36.67 0.32 ±0.06** 48.39 5(400μmol/L) 0.31 ±0.02** 50.00 0.22 ±0.06** 63.33 0.13 ±0.05**1(對照組)79.03
2.凋亡細胞的檢測結(jié)果:通過熒光顯微鏡下觀察到凋亡早期細胞形狀不規(guī)則,如呈新月形,核質(zhì)體呈綠色;凋亡晚期細胞大小不一,可見胞質(zhì)芽狀突起,核質(zhì)體呈橙色,染色質(zhì)濃縮,見圖 1。200、300、400μmol/L CoCl2處理24、48h后的細胞凋亡率均顯著高于對照組(p<0.01)(表2)。
表2 不同濃度CoCl2作用不同時間對細胞凋亡的影響(n=3
表2 不同濃度CoCl2作用不同時間對細胞凋亡的影響(n=3
與對照組比較,*P <0.01,**P <0.001
組別 組別(μmol/L)細胞凋亡率(%)(24h)細胞凋亡率(%)(48h)2.23 ±0.41 2.55 ±0.48 CoCl2 組 200 9.34 ±0.87* 12.13 ±1.61**300 12.93 ±1.50** 21.25 ±3.52**400 19.17 ±2.93** 26.09 ±1.80對照組 -**
3.total-Akt、p-Akt及 survivin 蛋白表達的檢測結(jié)果:300、400μmol/L CoCl2作用 48h 后 p -Akt、survivin蛋白表達量較對照組顯著減少(p<0.01),300μmol/L CoCl2作用36、48h較對照組能顯著下調(diào)p-Akt、survivin蛋白表達量(P <0.01),而 total-Akt蛋白表達量均無顯著變化。結(jié)果見圖2、圖3,表3、表4。
圖2 不同濃度CoCl2作用48h后total-Akt、p-Akt及survivin蛋白表達
表3 不同濃度CoCl2作用48h后total-Akt、p-Akt及survivin蛋白表達(n=3)
表3 不同濃度CoCl2作用48h后total-Akt、p-Akt及survivin蛋白表達(n=3)
與對照組比較,*P <0.01,**P <0.001
- 0.20 ±0.01 0.39 ±0.03 0.46 ±0.03 CoCl2 組 200 0.22 ±0.02 0.38 ±0.02 0.40 ±0.02 300 0.20 ±0.03 0.28 ±0.01* 0.30 ±0.03**400 0.19 ±0.02 0.14 ±0.03**0.11 ±0.03 total-Akt p-Akt survivin對照組組別(μmol/L)**
圖3 400μmol/L CoCl2作用不同時間后total-Akt、p-Akt及survivin蛋白表達
表4 400μmol/L CoCl2作用不同時間后total-Akt、p-Akt及survivin蛋白表達(n=3
表4 400μmol/L CoCl2作用不同時間后total-Akt、p-Akt及survivin蛋白表達(n=3
與對照組比較,*P <0.01,**P <0.001
- 0.21 ±0.03 0.37 ±0.04 0.38 ±0.03 CoCl2 組 24h 0.22 ±0.05 0.26 ±0.02* 0.34 ±0.03 36h 0.20 ±0.02 0.20 ±0.03** 0.22 ±0.02**48h 0.17 ±0.04 0.15 ±0.02** 0.15 ±0.02 Total-Akt p-Akt survivin對照組分組**
正常氧供給條件下,鈷通過細胞內(nèi)離子置換使亞鐵螯合酶失活,抑制細胞氧化反應(yīng),從而達到常氧下模擬細胞缺氧的目的。我們采用CoCl2處理A549細胞,模擬體外細胞化學(xué)性缺氧進行實驗。應(yīng)用MTT法和細胞形態(tài)學(xué)檢測證實CoCl2對A549細胞具有明顯的毒性作用,且呈劑量-時間依賴性地增加細胞生長抑制率并誘導(dǎo)其凋亡,400μmol/L作用48h細胞生長抑制率高達79%,細胞凋亡率高達26%。
AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它處在多條信號通路的重要交叉點,在細胞的存活和介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生中有重要作用,并且已經(jīng)成為腫瘤治療的新靶點之一[3]。p-Akt是AKT的功能活化狀態(tài),在大部分腫瘤中高表達,其活化過程可分為PI3K依賴和非PI3K依賴兩種。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)是細胞內(nèi)磷脂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,Akt處在PI3K/Akt信號通路的中心環(huán)節(jié),是PI3K下游的直接靶蛋白,Akt催化結(jié)構(gòu)域的Thr308及Ser473位點的磷酸化而被激活,成為p-Akt[4],只有 p-AKT 才具有生物學(xué)特性。本實驗Western blotting法檢測了CoCl2處理前后的Akt、p-Akt蛋白表達變化,結(jié)果顯示p-AkT蛋白表達量比對照組下降,統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異,且呈劑量-時間依賴性,而總AKT蛋白改變無顯著性差異,說明p-AkT是細胞內(nèi)早反應(yīng)事件,證實該信號通路被化學(xué)性缺氧阻斷。p-AkT抑制細胞凋亡與其能夠磷酸化激活下游一系列分子如Bcl-2家族、Foxo家族、lAPs家族、半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-9、Bad、NF - κB 等成員有關(guān),保護細胞不發(fā)生凋亡[5~8]。
經(jīng)典的凋亡通路有死亡受體通路和線粒體通路,最后都激活天冬氨酸特異性caspase家族導(dǎo)致凋亡的發(fā)生,而凋亡抑制蛋白(IAPs)家族起抑制凋亡的作用[9]。survivin是IAPs家族的一個新成員,是目前發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子。研究證實,它在肺癌組織中表達高達90%,并且是非小細胞肺癌最顯著的預(yù)后影響因子之一[10]。survivin的高表達可抑制 Fas、Bax、caspase以及抗腫瘤藥物等多種因素所誘導(dǎo)的細胞凋亡。本實驗檢測結(jié)果顯示,CoCl2處理后的survivin蛋白表達水平顯著下降,并呈劑量-時間依賴性,促進細胞凋亡的發(fā)生。而且本研究也探討了p-Akt和survivin的關(guān)系,結(jié)果表明p-Akt和 survivin表達呈正相關(guān),提示在A549細胞中survivin的高表達可能與Akt的活化有關(guān)。Fornaro等在前列腺癌細胞及CD34+的臍血細胞中也證實了存在Akt/survivin通路。
基于以上實驗結(jié)果可證實,CoCl2誘導(dǎo)A549細胞凋亡與阻斷Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,下調(diào)survivin表達發(fā)病機制占有重要地位,但細胞凋亡過程是多系統(tǒng)、多因素參與的復(fù)雜過程,是否還有其他機制的參與,具體的機制尚有待進一步實驗研究證實。
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