郭莉群，楊解人，孔 祥

(皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽蕪湖 241003)

2型糖尿病的血管并發(fā)癥是患者死亡和致殘的主要原因之一。血管內(nèi)皮細胞功能損傷被認為是其發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。一氧化氮(NO)是內(nèi)皮細胞行使其正常生理功能的重要信息分子，目前研究認為NO氧化失活增多及生成減少是導(dǎo)致糖尿病血管NO生物活性降低重要原因［1－2］。芝麻素(Sesmin，Ses)是芝麻中主要的活性成分，具有抗氧化、調(diào)脂和降壓等功效［3－4］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Ses通過抗氧化應(yīng)激改善飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征大鼠的心肌、腎臟及血管內(nèi)皮損傷［5－7］;通過增加肝脂酶活性，降低血管黏附分子ICAM-1蛋白表達改善腎性高壓伴高脂大鼠血脂紊亂，防治動脈粥樣硬化［8］。但芝麻素對2型糖尿病大鼠血管的保護作用至今未見報道。本實驗采用高脂飲食加注射小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立2型糖尿病大鼠模型，觀察芝麻素對主動脈eNOS、硝基酪氨酸(NT)和NADPH氧化酶亞基P47phox的蛋白表達的影響，以探討其防治糖尿病血管內(nèi)皮損傷的作用及可能機制。

1 材料

1.1 動物和飼料 7周齡♂ SD大鼠，體質(zhì)量200～240 g，購自浙江省試驗動物中心，許可證號:SCXK(浙)20080033。大鼠飼料購自南京青龍山實驗動物中心。高脂飼料配方見文獻報道并稍作修改［9］，飼料的熱量組成和密度如下，高脂飼料:蛋白19.5%，脂肪49.9%，碳水化合物30.5%和4.3 kcal·g－1;普通飼料:蛋白27.8%，脂肪12.8%，碳水化合物 59.3% 和 3.1 kcal·g－1。

1.2 主要試劑和藥物 Ses，相對分子質(zhì)量351.34，純度＞94% ，蕪湖天一綠寶科技有限公司;STZ、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、左旋硝基精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine-methyl-ester，L-NAME)購于 Sigma公司。苯腎上腺素(phenylephrine，PE)購于上海禾豐制藥有限公司。胰島素(insulin，Ins)放免試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。甘油三酯(triglyceride，TG)和葡萄糖試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。NT和P47phox抗體購自Santa Cruz公司。eNOS和β-actin抗體購自武漢博士德公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;ECL試劑盒購于Pierce公司。

2 方法

2.1 模型制備、分組及處理 參照文獻方法［2］將40只♂SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，8只用普通飼料喂養(yǎng)，32只用高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，空腹?fàn)顟B(tài)下腹腔注射低劑量STZ(40 mg·kg－1)，正常組腹腔注射檸檬酸鈉做對照。2周后尾靜脈取血測血糖≥7.8 mmol·L－1大鼠定義為2型糖尿病大鼠。將造模成功大鼠隨機分為模型組(DM，n=8)，Ses高、低劑量治療組(120、60 mg·kg－1，n=8)。每日上午 9時灌胃給藥，1 h后自由進食(治療組和模型組為高脂飼料，正常對照組為普通飼料)連續(xù)給藥8周。14周末，大鼠禁食12 h，麻醉后腹主動脈取血，分離血清。取血后開胸，迅速分離胸主動脈，放入預(yù)冷的K-H液中，剪取2段長約3 mm的主動脈環(huán)。其余血管凍存于－80℃冰箱備用。

2.2 離體血管功能測定 具體操作見作者之前報道［10］。分別將動脈環(huán)懸掛于盛有 K-H液、37℃恒溫的A、B兩個浴槽中。1.5 g前負荷平衡1 h。1 μmol·L－1NE預(yù)收縮血管，待收縮曲線至平臺期后沖洗，確認反應(yīng)穩(wěn)定后按以下次序試驗:A浴槽用1 μmol·L－1PE收縮血管，穩(wěn)定后觀察累積濃度ACh(10 nmol·L－1～100 μmol·L－1)誘導(dǎo)血管舒張反應(yīng)。主動脈舒張反應(yīng)以血管舒張張力占1 μmol·L－1PE引起收縮張力的百分比表示。B浴槽用1 μmol·L－1PE 收縮血管，穩(wěn)定后觀察 100 μmol·L－1L-NAME引起的血管收縮反應(yīng)。L-NAME阻斷NOS后引起的收縮/PE誘導(dǎo)的收縮來反映血管NO的生活物性。

2.3 血液指標(biāo)檢測 酶法測定血清TG和空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)含量，放射免疫法測血清空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)Ins)水平，比色法測血清MDA含量和T-AOC活性，嚴(yán)格按說明書正規(guī)操作。

2.4 Western blot檢測血管 eNOS、NT 和 P47phox蛋白表達 分別提取心肌組織核蛋白和總蛋白，取上清用Lowry法進行蛋白定量。樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫封閉2 h。洗膜后分別加入一抗，4℃孵育過夜。洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，拍攝照片。根據(jù)積分吸光度(integrated absorbance，IA)值對比分析條帶強弱，以β-actin為內(nèi)參照進行半定量分析。

3 結(jié)果

3.1 對糖尿病大鼠血糖、胰島素和血脂的影響 模型組FBG，Ins和TG較正常對照組明顯增高(P＜0.05)。與模型組相比，Ses可降低 FBG和 Ins水平，但差異無統(tǒng)計學(xué)。Ses(120 mg·kg－1)組的TG明顯降低(P＜0.05)。表明Ses具有降脂作用，與作者之前報道一致(Tab 1)。

Tab 1 Effect of Ses on FBG，Ins and TG in diabetic rats(± s，n=8)

Tab 1 Effect of Ses on FBG，Ins and TG in diabetic rats(± s，n=8)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs model

Group Dose/mg·kg－1 FBG/mmol·L －1 Insulin/mlU·L－1 TG/mmol·L －1 Control － 5.78 ±1.26 36.75 ±6.31 0.86 ±0.14 Model － 12.55 ±3.05* 24.19 ±5.46* 1.73 ±0.33*Ses 120 10.75 ±1.80* 28.67 ±2.99* 1.19 ±0.25#60 11.24 ±2.30* 27.54 ±5.63* 1.48 ±0.24*

3.2 對糖尿病大鼠血清MDA和T-AOC的影響模型組MDA含量明顯升高，T-AOC明顯降低(P＜0.05)。與模型組相比，Ses(120 mg·kg－1)組 MDA明顯降低，Ses(120，60 mg·kg－1)組 T-AOC 明顯升高(P＜0.05)。表明Ses具有抗氧化應(yīng)激作用(Tab 2)。

Tab 2 Effect of Ses on serum MDA and T-AOC in diabetic rats(±s，n=8)

Tab 2 Effect of Ses on serum MDA and T-AOC in diabetic rats(±s，n=8)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs model

Group Dose/mg·kg－1MDA/μmol·L－1T-AOC/kU·L －1 Control － 3.94 ±1.14 26.28 ±7.94 Model － 9.93 ±2.73* 11.53 ±2.62*Ses 120 5.12 ±1.26# 20.20 ±3.07#60 6.88 ±2.11* 15.87 ±3.41*#

3.3 對糖尿病大鼠離體主動脈環(huán)的影響 由Fig 1可見，模型組血管環(huán)對 10－6、10－5、10－4mol·L－1濃度ACh誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)較正常對照組均明顯下降(P＜0.05)，與模型組相比，Ses(120 mg·kg－1)治療后能提高主動脈對ACh的舒張反應(yīng)性。

Fig 1 Effects of Ses on the vascular relaxant responses induced by ACh in aortic rings precontracted by 10－6mol·L－1PE(±s，n=8)

由Fig 2可見，模型組血管NO生物活性較正常對照組明顯下降(P＜0.05);與模型組比較，Ses(120 mg·kg－1)可明顯提高NO活性。

3.4 對糖尿病大鼠血管eNOS、P47phox和NT蛋白表達的影響 由Fig 3可見，模型組血管eNOS表達較正常對照組降低57.8%;p47phox和NT表達分別增加1.11倍和2.78倍(P＜0.05)。Ses 120，60 mg·kg－1組 eNOS表達較模型組增加 76.3%和64.9%;P47phox表達分別降低41.3%和21.6%;NT表達分別降低36.8%和19.8%(P＜0.05)。

Fig 2Effects of Ses on NO bioactivity in aortic rings(±s，n=5)

4 討論

糖尿病發(fā)病過程中，長期高血糖形成的胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂和氧化應(yīng)激等多因素相互影響，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能不斷損傷。本實驗中模型組大鼠血清MDA含量升高，T-AOC活性下降，提示糖尿病大鼠存在明顯氧化應(yīng)激，體內(nèi)過多的超氧化物可直接使NO失活，也可使NOS脫偶聯(lián)，導(dǎo)致NO生成減少。另外大量的超氧陰離子(O2－)與NO反應(yīng)生成的過氧化亞硝酸鹽(ONOO－)能明顯減弱抗氧化酶清除氧自由基的能力，并造成的血管損傷。近年來發(fā)現(xiàn)，NADPH氧化酶是血管組織產(chǎn)生O2－的關(guān)鍵酶，其亞基P47phox的磷酸化是NADPH氧化酶產(chǎn)生O2

－的始動步驟［11］。本實驗結(jié)果顯示模型組大鼠血管NT(內(nèi)源性O(shè)NOO－生成的特異性標(biāo)志物)及P47phox的蛋白表達明顯增高，而芝麻素治療后可降低其蛋白表達，同時降低血清MDA含量，提高TAOC活性，說明芝麻素改善糖尿病大鼠血管損傷的作用與其提高機體抗氧化應(yīng)激能力，減少NO氧化失活有關(guān)。此外，芝麻素治療后大鼠體內(nèi)TG含量降低，說明芝麻素亦可減輕大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)紊亂來降低血管氧化應(yīng)激損傷。

糖尿病血管內(nèi)皮損傷表現(xiàn)為血管收縮與舒張功能失調(diào)。本實驗發(fā)現(xiàn)模型組大鼠胸主動脈ACh誘導(dǎo)血管舒張效應(yīng)明顯下降，提示糖尿病時血管內(nèi)皮細胞已發(fā)生損傷。ACh可通過內(nèi)皮衍生的NO、內(nèi)皮依賴性超極化因子(EDHF)和前列環(huán)素(PGI2)等內(nèi)皮舒張因子介導(dǎo)血管舒張。其中eNOS合成的NO在大血管的舒張效應(yīng)中發(fā)揮最為重要的作用［12］。何敏等研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠內(nèi)皮依賴性血管舒張功能下降，內(nèi)皮合成NO的水平和主動脈中eNOS表達明顯降低［12－13］。本實驗亦得出相同結(jié)果，芝麻素治療8周后糖尿病大鼠血管eNOS蛋白表達增強，反映血管NO生物活性的L-NAME(NOS抑制劑)誘導(dǎo)收縮/PE誘導(dǎo)收縮的比值升高。Nakano等也報道［14］，Ses代謝物對 DOCA-鹽敏感性高血壓大鼠舒血管作用分別被NOS和鳥苷酸環(huán)化酶(GC)阻斷藥所抑制。這些均提示Ses改善血管舒張功能是NO介導(dǎo)，而不完全依賴Ses的抗氧化特性。

Fig 3 Effect of Ses on protein expression of eNOS，NT and P47phoxin aortas from diabetic rats(±s，n=5)

綜上所述，芝麻素對糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷具有防治作用，機制可能與其下調(diào)血管NADPH氧化酶表達，提高抗氧化應(yīng)激能力減輕NO失活和上調(diào)eNOS表達，增加NO水平及生物活性的作用有關(guān)。

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