馬紅雨，宋世平，董 磊，羅 丹，呂建曉，楊 鯤

(1.空軍總醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，北京 100142;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100071;3.第四軍醫(yī)大學(xué)解剖學(xué)教研室暨梁球鋸腦研究中心，陜西西安 710032)

γ-氨基丁酸 (GABA)是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。GABA在神經(jīng)系統(tǒng)的受體目前已經(jīng)確認(rèn)3種:離子型GABAA受體是一種氯離子通道;GABAB受體是一種與胞內(nèi)G蛋白偶聯(lián)的代謝型受體;而GABAC受體局限分布于視網(wǎng)膜［1－2］。其中，GABAB受體參與廣泛的抑制作用，其對疼痛信號的傳遞和抑制的作用已經(jīng)有較多報道［2－5］。對 GABAB受體功能的研究，主要是通過GABAB受體的特異性激動劑baclofen。以baclofen激動GABAB受體，可抑制急性和慢性疼痛信號的傳遞。然而，baclofen的應(yīng)用很快引起耐受，這一特點(diǎn)限制了其在臨床上的應(yīng)用，同時提示需要尋找有baclofen類似功能的 GABAB受體激動劑替代物［1］。SKF97541是一種對GABAB受體親和度比baclofen高的特異性 GABAB受體激動劑［1］。對 SKF97541的藥理學(xué)研究表明，該藥物廣泛作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。但其在傷害性信息傳遞和調(diào)控中的作用，尚未見報道。

骶髓后聯(lián)合核(sacral dorsal commissural nucleus，SDCN)是位于哺乳動物和人類的脊髓灰質(zhì)腰骶段中央管后外側(cè)核團(tuán)。在大鼠脊髓，SDCN出現(xiàn)在腰6(L6)至骶4(S4)段。SDCN神經(jīng)元接受軀體感覺和內(nèi)臟感覺初級傳入，并將初級傳入信息向?qū)?cè)脊髓以上核團(tuán)投射［6］。我們的系列研究表明，SDCN神經(jīng)元突觸傳遞受GABAB受體激動劑baclofen和抑制劑 CGP52432 的調(diào)制［2，4－5，7］。但 SKF97541 是否對SDCN神經(jīng)元有作用，尚不清楚。我們擬用全細(xì)胞膜片鉗法，研究SKF97541對SDCN的可能作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 離體脊髓薄片標(biāo)本制作 實(shí)驗(yàn)對象為5～7周成年♂Sprague-Dawley(SD)大鼠。脊髓薄片制作方法同前［8－9］。概言之，用烏拉坦(1.5 g·kg－1體重)腹腔注射將動物麻醉，沿背正中線由骶髓水平向上至胸髓水平剪開皮膚，沿椎骨棘突兩側(cè)分開肌肉，暴露橫突，小心切除椎板，暴露脊髓。將脊髓于胸段水平橫斷，向下至全骶髓連同蛛網(wǎng)膜和軟膜一并取出，迅速置于0℃ ～1℃的冰水混合物狀的人工腦脊液［ACSF，成分為(mmol·L－1):NaCl 120，KCl 3，Mg-SO41，NaH2PO41.2，CaCl22.5，NaHCO325，glucose 10］中。修剪除去前根和背根，細(xì)心剝離蛛網(wǎng)膜和軟膜。振動切片機(jī)(DTK-1000，Dosaka EM，日本)切取厚度為500 μm的腰骶段脊髓橫切薄片。將標(biāo)本轉(zhuǎn)移到記錄槽中，ACSF持續(xù)灌流(速度～10 ml/min;36℃ +1℃)進(jìn)行預(yù)孵育。

1.2 藥品與溶液 SKF97541，河豚毒素 (TTX)，谷氨酸受體AMPA亞型特異性拮抗劑CNQX(6-cyano-7-nitroquinoxaline-2，3-dione)，GABAA受體拮抗劑picrotoxin和甘氨酸受體拮抗劑士的寧(strychnine)均購自美國Sigma公司。記錄谷氨酸介導(dǎo)的興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic currents，EPSCs)時，加入 GABAA受體拮抗劑 picrotoxin(50 μmol·L－1)和甘氨酸受體拮抗劑 strychnine(1 μmol·L－1);電極細(xì)胞內(nèi)液成分為(mmol·L－1):K-gluconate 135，KCl 5，CaCl20.5，MgCl22，EGTA 5，Hepes 5，Mg-ATP 3.6(以KOH調(diào)至pH 7.2)。

1.3 全細(xì)胞記錄與給藥方式 脊髓薄片預(yù)孵育30 min開始記錄。以“盲插膜片鉗法”(blind patch)形成全細(xì)胞電壓鉗記錄，方法如前文詳述［9］。在鉗制電壓為－70 mV時，可以觀察到自發(fā)的EPSCs(spontaneous EPSCs，sEPSCs)［4］;ACSF 加入河豚毒素(0.5 μmol·L－1)時，動作電位被阻斷，可記錄到不依賴動作電位的微小 EPSCs(miniature EPSCs，mEPSCs)［4，8］;將一根同心圓電極預(yù)先放置于被記錄神經(jīng)元50～200 μm處，在電流鉗模式下，通過刺激器給予適當(dāng)強(qiáng)度的刺激，可以記錄到突觸前刺激引起的突觸后電位(evoked postsynaptic potentials;ePSPs)［4］。模式/數(shù)字信號轉(zhuǎn)換系統(tǒng)和記錄軟件分別 為 Digidata1200A analog/digitalinterface和pClamp 8(均購自Axon Instruments)。

事先將藥物用蒸餾水或二甲基亞砜(DMSO)制成1 000～5 000倍濃度儲備液。給藥前以ACSF稀釋至使用濃度。采用灌流方式給藥，分別記錄給藥前(對照組)，給藥后(實(shí)驗(yàn)組)及洗脫后的電流或電壓變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用ClampFit 8.0(Molecular Devices，美國)分析。數(shù)據(jù)在StatView(Apple McIntosh，美國)或 SigmaPlot 9.0(Systat Software Inc，美國)上進(jìn)行計算和統(tǒng)計學(xué)比較。均值以±s表示。n代表檢測細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果處理用 Student’s t-test(t檢驗(yàn))，two-way ANOVA檢驗(yàn)或Kolmogorov-Smirnov test(K-S檢驗(yàn))。

2 結(jié)果

2.1 SKF97541對SDCN神經(jīng)元的膜電位和動作電位發(fā)放的影響 在電壓鉗模式下，以玻璃微電極(尖端直徑 ～ 1 μm，充滿電極內(nèi)液時阻抗6～10 MΩ)對神經(jīng)元形成高阻封接，待全細(xì)胞電壓鉗記錄模式形成并破膜成功后，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娏縻Q記錄模式。向SDCN細(xì)胞內(nèi)注射適當(dāng)?shù)娜O化電流(直流)，可誘發(fā)出動作電位和神經(jīng)元的連續(xù)放電。如Fig 1A所示，神經(jīng)元以一定頻率持續(xù)發(fā)放動作電位，灌流SKF97541(0.5 μmol·L－1，30 s)［1］引起一個超極化膜電位，并引起所有神經(jīng)元的放電頻率由對照組的(10.7±3.1)Hz降低到0 Hz，經(jīng)過洗脫后，動作電位發(fā)放恢復(fù)(n=11)。預(yù)先灌流GABAB受體拮抗劑CGP52432可部分增高動作電位的發(fā)放頻率，并阻斷SKF97541的上述作用(Fig 1B，C)。以上結(jié)果提示，SKF97541通過作用于GABAB受體，降低SDCN神經(jīng)元的興奮性，同時促進(jìn)神經(jīng)元膜電位超極化，即膜電位向更加穩(wěn)定的方向移動。

Fig 1 SKF97541 inhibits sacral dorsal commissural nucleus(SDCN)neurons

2.2 SKF97541對SDCN神經(jīng)元微小興奮性突觸后電流(mEPSCs)的影響 當(dāng)鉗制電壓設(shè)置為－70 mV 時，可記錄到自發(fā)的 sEPSCs［4，9］，ACSF 加入河豚毒素(0.5 μmol·L－1)時，可以記錄到不依賴動作電位的 mEPSCs［6］。mEPSCs的平均頻率為(2.4±0.6)Hz，平均振幅為(15.1 ±3.1)pA(n=14)。灌流液加入 SKF97541(0.5 μmol·L－1，30 s)，可以觀察到mEPSCs的頻率有明顯降低(Fig 2A);如Fig 2B、C所示，mEPSCs的平均頻率為對照組的(280+26)%(P＜0.01);振幅為對照組的(104±9)%(P=0.07)。提示SKF97541對mEPSCs的頻率降低作用，源于突觸前 GABAB受體［4，8］。

Fig 2 SKF97541 reduces the frequency，but not amplitudeof miniature EPSCs(mEPSCs)in SDCN neurons

2.3 SKF97541對突觸前刺激引起突觸后電位(ePSPs)的影響 電流鉗模式下，當(dāng)鉗制電流為0 nA時，神經(jīng)元接近其生理狀態(tài)。在突觸前施加適當(dāng)?shù)碾姶碳?，可誘導(dǎo)出刺激引起的ePSPs。兩次刺激(paired-pulse)之間設(shè)定適當(dāng)間隔，可產(chǎn)生兩個ePSPs，第2次刺激引起的ePSPs幅度與第1次刺激引起的ePSPs的比值，稱為配對刺激比(paired-pulse ratio，PPR)。如 Fig 3A 所示，SKF97541(0.5 μmol·L－1，30 s)降低 ePSPs幅度，同時增加 PPR。在所有11個檢測的神經(jīng)元上，第1個ePSPs的幅度降低至對照組的(68±8)%(P＜0.01);PPR由(88±5)%增加至(110±6)%(P＜0.05，F(xiàn)ig 3B)。進(jìn)一步提示SKF97541對ePSPs和PPR的作用是通過突觸前GABAB受體而實(shí)現(xiàn)。

Fig 3 SKF97541 significantly reduces the amplitude of evoked postsynaptic potentials(ePSPs)and increases the paired-pulse ratio(PPR)in SDCN neurons

3 討論

我們的既往研究表明，以baclofen激動脊髓背角的GABAB受體，抑制初級傳入終末谷氨酸釋放［2，5，8］;反之，以 GABAB受體阻斷劑 CGP52432 阻斷該受體，促進(jìn)谷氨酸釋放［5］。本研究以GABAB受體特異性激動劑SKF97541處理SDCN神經(jīng)元，其抑制效應(yīng)與baclofen類似。

GABAB受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛分布。在脊髓，其表達(dá)主要在接受傷害性刺激的背角神經(jīng)元，同時，位于脊髓中央管背外側(cè)的SDCN也有廣泛分布。在SDCN的GABAB受體陽性結(jié)構(gòu)既有胞體，也有陽性終末［2］，提示激活或阻斷GABAB受體，可能在突觸前和突觸后均發(fā)揮作用［4］。本實(shí)驗(yàn)中，SKF97541抑制SDCN神經(jīng)元動作電位的發(fā)放，同時，引起細(xì)胞膜電位的超極化，提示SKF97541對突觸后膜的直接抑制作用［8］。該作用可被GABAB受體特異性拮抗劑CGP52432所阻斷，提示其作用是通過GABAB受體而實(shí)現(xiàn)的。其作用方式與我們在中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)觀察到的baclofen作用類似［8］。

值得提出的是，GABAB受體特異性拮抗劑CGP52432本身可以引起動作電位發(fā)放頻率的增加(Fig 1B，C)，說明SDCN神經(jīng)元受其周圍的GABA調(diào)控，該結(jié)論也與我們此前的研究類似［4－5］。

SKF97541對mEPSCs的平均振幅無明顯影響，但明顯增加微小突觸電流的間隔。根據(jù)經(jīng)典電生理學(xué)理論，此結(jié)果表明SKF97541通過突觸前受體而發(fā)生抑制效應(yīng)［11］。形態(tài)學(xué)研究表明SDCN內(nèi)有廣泛的GABAB受體陽性終末，這些形態(tài)學(xué)證據(jù)也支持本實(shí)驗(yàn)中觀察到的結(jié)果。因此，除上述的SKF97541突觸后直接抑制作用，它同時通過對突觸前谷氨酸釋放的調(diào)節(jié)，參與對SDCN神經(jīng)元的調(diào)節(jié)。ePSPs是突觸后電位的總和，SKF97541抑制ePSPs的幅度，同時增加PPR，也提示其突觸前作用［11］;此作用是由于SKF97541抑制突觸前GABAB受體導(dǎo)致。

GABAB受體是一種與胞內(nèi)G蛋白偶聯(lián)的代謝型受體。SKF97541可能將GABAB受體激活后，引起K通道開放，神經(jīng)元膜電位超極化;同時與G蛋白偶聯(lián)的Ca2+通道被抑制，自發(fā)的和刺激引起的神經(jīng)遞質(zhì)釋放減少［2，7－8，10］。其詳細(xì)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

戒斷、依賴、成癮等副作用是目前鎮(zhèn)痛藥物在臨床使用的主要問題。因此，尋找新型鎮(zhèn)痛藥物是神經(jīng)藥理學(xué)基礎(chǔ)和臨床研究的重點(diǎn)。GABAB受體因其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中穩(wěn)定的抑制作用，而成為研究的熱點(diǎn)［1］。SKF97541的結(jié)構(gòu)與baclofen不同，且其與GABAB受體的親和性是后者的10倍。例如，SKF97541和balcofen對紋狀體突觸的抑制作用的EC50 分別為 920 nmol·L－1和 1.25 μmol·L－1［12］。因此SKF97541成為作用于GABAB受體的一種具有潛在開發(fā)價值的候選藥物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SKF97541在接受痛覺傳入的SDCN神經(jīng)元有廣泛的抑制作用，此作用可能參與傷害性信息在脊髓水平的傳遞和抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對開發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥物，也有一定的參考價值［1，12］。

［1］Goudet C，Magnaghi V，Landry M，et al.Metabotropic receptors for glutamate and GABA in pain［J］.Brain Res Rev，2009，60(1):43－56.

［2］Yang K，Wang D，Li Y Q.Distribution and depression of the GABABreceptor in the spinal dorsal horn of adult rat［J］.Brain Res Bull，2001，55(4):279－85.

［3］朱珊珊，譚珊珊，曾應(yīng)明.鞘內(nèi)注射巴氯酚對神經(jīng)病理性痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用及其對脊髓GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體-1的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2011，27(10):1443－7.

［3］Zhu S S，Tan S S，Zeng Y M.Effect of intrathecal injection of GABABreceptor agonist baclofen on hyperalgesia and spinal GAT-1 of neuropathic rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(10):1443－7.

［4］Yang K，Ma H.Blockade of GABABreceptors facilitates evoked neurotransmitter release at spinal dorsal horn synapse［J］.Neuroscience，2011，193(3):411－20.

［5］馬紅雨，林 凱，羅 丹，等.周邊 γ-氨基丁酸通過GABAB受體調(diào)控骶髓后聯(lián)合核神經(jīng)元谷氨酸能突觸［J］.中國藥理學(xué)通報，2011，27(9):1231－5.

［5］Ma H Y，Lin K，Luo D，et al.Ambient GABA modulates glutamatergic synapse in sacral dorsal commissural nucleus by presynaptic GABABreceptors［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(9):1231－5.

［6］李繼碩.脊髓［M］.//李繼碩.神經(jīng)科學(xué)基礎(chǔ).北京:高等教育出版社，2002:116－44.

［6］Li J S.Spinal cord［M］//Li J S.Basic neuroscience.Beijing:High Education Press，2002:116－44.

［7］馬紅雨，楊 鯤.氯苯氨丁酸抑制脊髓背角神經(jīng)元谷氨酸釋放的機(jī)制［J］.中國藥理學(xué)通報，2004，20(9):981－4.

［7］Ma H Y，Yang K.Mechanism for baclofen inhibition on quantal glutamate release in spinal dorsal horn neurons［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(9):981－4.

［8］Yang K，Kumamoto E，F(xiàn)urue H，et al.Pre-and postsynaptic inhibition mediated by GABABreceptors in rat ventrolateral periaqueductal gray neurons［J］.Biochem Biophys Res Comm，2003，302(2):233－7.

［9］Yang K，Li Y Q，Kumamoto E，et al.Voltage-clamp recordings of postsynaptic currents on substantia gelatinosa neuronsin vitroand its applications to assess synaptic transmission［J］.Brain Res Protocols，2001，7(3):235－40.

［10］Pfrieger F W，Gottmann K，Lux H D.Kinetics of GABABreceptormediated inhibition of calcium currents and excitatory synaptic transmission in hippocampal neuronsin vitro［J］.Neuron，1994，12(1):97－107.

［11］Dobrunz L E，Stevens C F.Heterogeneity of release probability，facilitation，and depletion at central synapses［J］.Neuron，1997，18(6):995－1008.

［12］Mares P.Anticonvulsant action of GABABreceptor agonist SKF97541 differs from that of baclofen［J］.Physiol Res，57(5):789－92.