鄧 寧，高 華，，國(guó)亞芳，邱曉峰，馮 軍，鄭 萍，戴貴東，3

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，3.寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，寧夏銀川 750004)

苦參堿(matrine)是從寧夏特色回藥材豆科槐屬植物苦豆子(Sophore alopecuroidesL)中提取的生物堿之一，具有抗炎、抗心律失常、抗乙肝病毒和抗腫瘤等多種藥理作用［1－4］，對(duì)肺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，并可誘導(dǎo)其分化或(和)凋亡［4－6］。本研究旨在通過(guò)大鼠膀胱癌模型的建立，重點(diǎn)觀察苦參堿對(duì)膀胱癌的抑制作用及對(duì)膀胱組織中COX-2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)♂ Sprague-Dawley大鼠，7～8

周齡，體質(zhì)量120～160 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(寧)2009-0003。

1.2 藥品與試劑 苦參堿購(gòu)自寧夏紫荊花藥業(yè)股份有限公司，純度＞99.0%，批號(hào):P0100226。塞來(lái)昔布(celecoxib)購(gòu)自武漢嘉凱隆科技發(fā)展有限公司，純度 ＞99.5%，批號(hào):20081116。N-丁基-N-(4-羥丁基)亞硝基胺(BBN)購(gòu)自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社，其原液呈棕黃色，油狀透明，4℃冰箱貯存，臨用時(shí)以乙醇/水(乙醇∶水=20∶80)配制成BBN混懸溶液使用。COX-2免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒以及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 給藥方法及分組 大鼠隨機(jī)分為6組，分別是空白對(duì)照組(Control)、BBN組、塞來(lái)昔布(500 mg·kg－1)組和苦參堿(50、100、200 mg·kg－1)組。除空白對(duì)照組給予等體積溶劑對(duì)照溶液外，其余各組灌胃給予膀胱癌致癌劑BBN按每只200 mg/0.5 ml，每周2次，連續(xù)8周。塞來(lái)昔布組和苦參堿組在給予BBN前1周開(kāi)始，空白對(duì)照組和BBN組給予等容量NS，均采用灌胃方式給藥，每日1次，連續(xù)35周。各組動(dòng)物于35周后處死。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于灌胃操作引起肺、胃損傷及其他不明原因造成死亡的大鼠被排除在統(tǒng)計(jì)分析之外。

1.4 膀胱組織病理 全部實(shí)驗(yàn)大鼠于35周稱重后處死，剝離膀胱并稱量其重量，計(jì)數(shù)各組膀胱重量＞200 mg的個(gè)數(shù)以判斷腫瘤的生長(zhǎng)情況［7］。用10%中性福爾馬林固定24 h后石蠟包埋，切片厚4 μm，行常規(guī)HE染色后，鏡檢觀察、分析。

1.5 大鼠膀胱COX-2蛋白表達(dá)的檢測(cè) 石蠟包埋的膀胱組織切片厚4 μm，按照SP免疫組化試劑盒說(shuō)明書操作，其中所用COX-2一抗?jié)舛葹?∶100。設(shè)PBS代替一抗的陰性對(duì)照，COX-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)為胞質(zhì)染成棕黃色顆粒。由兩位病理醫(yī)師分別獨(dú)立對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行雙盲法評(píng)估。每一切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野(×100)，在顯微鏡(×400)下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取5個(gè)視野的平均百分?jǐn)?shù)為判定結(jié)果。以細(xì)胞染色強(qiáng)度和細(xì)胞陽(yáng)性百分率進(jìn)行計(jì)分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分:＜20%計(jì)0分，20% ～50%記1分，51%～80%記2分，＞80%記3分;根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分:無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，中等強(qiáng)度黃色為2分，出現(xiàn)棕黃色顆粒為3分。將陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分相加即COX-2蛋白表達(dá)評(píng)分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間均數(shù)的差異性比較采用One-way ANOVA分析;率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行分析。

Tab 1Effects of matrine on body weight and bladder weight in rats induced by BBN(±s)

Tab 1Effects of matrine on body weight and bladder weight in rats induced by BBN(±s)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs BBN group

Group Body weight/g Initial Final Weight gain No.Bladder Wt Greater Than 200 mg/Total No./%Control 158.7 ±27.4 568.7 ±55.3 410.0 ±70.1 (0/15)0 BBN 164.3 ±33.3 551.3 ±56.3 386.9 ±65.9 (20/20)100＊＊Celecoxib+BBN 157.6 ±27.3 551.0 ±59.8 393.4 ±59.5 (5/8)62.5＊＊#Matrine 50 mg·kg－1+BBN 144.6 ±36.6 471.7 ±54.9＊＊## 327.1 ±44.9＊＊## (13/19)68.4＊＊##Matrine 100 mg·kg－1+BBN 154.7 ±28.7 485.9 ±29.8＊＊## 331.2 ±37.1＊＊## (15/19)78.9＊＊#Matrine 200 mg·kg－1+BBN 172.0 ±26.1 444.6 ±40.3＊＊## 272.6 ±50.4＊＊## (5/8)62.5＊＊#

Tab 2 Histopathological diagnosis on bladder in rats*

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對(duì)大鼠體質(zhì)量和膀胱的影響 各組大鼠初始體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與空白對(duì)照組及BBN組比較，苦參堿各劑量組終末體質(zhì)量及體質(zhì)量增長(zhǎng)量均明顯下降(P＜0.01)。空白對(duì)照組膀胱重約140 mg，其他各組膀胱重量明顯增加(P＜0.01);與 BBN 組相比，苦參堿(50、100、200 mg·kg－1)組膀胱重量＞200 mg的比例明顯下降(P＜0.01，P＜0.05)，見(jiàn)Tab 1。形成的腫瘤，有的突入(出)膀胱腔，呈菜花狀，有的潰瘍伴出血壞死(Fig 1)。

2.2 苦參堿對(duì)大鼠膀胱腫瘤的影響 光鏡可見(jiàn)癌變的移行上皮細(xì)胞異型性明顯，乳頭狀生長(zhǎng)，細(xì)胞層次增多，表現(xiàn)為細(xì)胞大小不一，排列紊亂，極向消失，核大，形態(tài)不一，核畸形，核漿比例大，可見(jiàn)病理性核分裂象，部分標(biāo)本可見(jiàn)癌細(xì)胞侵犯粘膜固有層及肌層(Fig 2)。89只大鼠膀胱組織樣本經(jīng)HE染色病理分析，膀胱尿路上皮癌的發(fā)生率BBN組為70%(14/20)，塞來(lái)昔布組為25%(2/8)，苦參堿(50、100和 200 mg·kg－1)組分別為 68.4%(13/19)、57.9%(11/19)、37.5%(3/8)。與 BBN組相比，除塞來(lái)昔布組癌變率明顯降低(P＜0.05)外，苦參堿各劑量組癌變率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在確診的膀胱尿路上皮癌中，苦參堿(50、100 mg·kg－1)組浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌的發(fā)生率分別為15.4%(2/13)和9%(1/11)，較 BBN［50%(7/14)］組明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)Tab 2。

2.3 苦參堿對(duì)大鼠膀胱COX-2蛋白表達(dá)的影響COX-2蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色灶性或彌漫性分布。苦參堿(50、100和200 mg·kg－1)組大鼠膀胱COX-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率較BBN組明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn) Fig 3，Tab 3。

Fig 1 Bladder tissue in rats

3 討論

BBN以其代謝產(chǎn)物N-丁基-N-(3-羧丙基)亞硝基胺(BCPN)自尿液中排泄，直接接觸尿路上皮，并損傷上皮細(xì)胞DNA，而致細(xì)胞癌變。因BBN所誘發(fā)膀胱腫瘤為多發(fā)性，以上皮癌為主，與人類膀胱癌的組織學(xué)相似，而成為膀胱癌藥物篩選和作用機(jī)制研究的經(jīng)典動(dòng)物模型。文獻(xiàn)報(bào)道BBN所致膀胱癌的發(fā)生率為 55% ～85%［12，14］，本實(shí)驗(yàn) BBN 組癌變率為70%，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。

Fig 2 Hematoxylin-eosin staining in bladder tissue of rats(×200)A:Control group;B:BBN group

Tab 3Expression index of COX-2 in bladder of rats(±s)

Tab 3Expression index of COX-2 in bladder of rats(±s)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs BBN group;▲P＜0.05 vs Celecoxib group

Group n COX-2 protein index Control 15 0.87 ±0.83#▲BBN 20 3.70 ±1.17＊＊▲Celecoxib+BBN 8 2.25 ±1.04＊＊#Matrine 50 mg·kg－1+BBN 19 2.95 ±0.78＊＊#Matrine 100 mg·kg－1+BBN 19 2.58 ±0.96＊＊#Matrine 200 mg·kg－1+BBN 8 2.88 ±0.64＊＊#

苦參堿具有抗腫瘤作用，可誘導(dǎo)肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的分化或(和)凋亡，但以往的研究以體外實(shí)驗(yàn)為主，未見(jiàn)有關(guān)苦參堿對(duì)膀胱癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，為此，本實(shí)驗(yàn)以BBN誘發(fā)大鼠膀胱癌為模型，初步研究了苦參堿對(duì)膀胱癌的抑制作用及其機(jī)制。研究結(jié)果表明，苦參堿對(duì)BBN所誘發(fā)大鼠膀胱癌變率無(wú)影響，但可降低200 mg以上膀胱腫瘤的發(fā)生率和浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌的發(fā)生率，提示苦參堿對(duì)BBN誘導(dǎo)大鼠膀胱癌的發(fā)生無(wú)抑制作用，但對(duì)膀胱腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展具有抑制作用。

Fig 3 Expression of COX-2 in bladder of rats

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生與吸煙、職業(yè)接觸和慢性炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)，其中慢性炎癥反應(yīng)致膀胱癌的學(xué)說(shuō)近年來(lái)倍受關(guān)注，慢性炎癥反應(yīng)致膀胱上皮的增生及膀胱癌的發(fā)生與COX-2的異常表達(dá)及其介導(dǎo)的COX-2-mPGES信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常有關(guān)［8－9］。研究表明［10－14］，膀胱癌COX-2表達(dá)增高，給予COX-2選擇性和非選擇性抑制劑如:阿司匹林、吡羅昔康、吲哚美辛、塞來(lái)昔布等均可明顯抑制膀胱癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。由此可見(jiàn)，抑制COX-2的表達(dá)并影響其介導(dǎo)的效應(yīng)，是研究抗膀胱癌藥物極為重要的作用靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與BBN組比較，苦參堿(50、100和200 mg·kg－1)可明顯抑制大鼠膀胱COX-2蛋白的表達(dá)，提示苦參堿抑制膀胱癌進(jìn)展的作用機(jī)制與其抑制COX-2的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，苦參堿對(duì)BBN誘導(dǎo)大鼠膀胱癌的發(fā)生無(wú)抑制作用，但對(duì)膀胱癌的生長(zhǎng)和進(jìn)展具有抑制作用，其機(jī)制與抑制大鼠膀胱組織中COX-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。

［1］張 婉，潘振偉，馮鐵明，等.苦參堿對(duì)缺血性心室肌細(xì)胞快速延遲整流鉀電流的作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(3):322－6.

［1］Zhang W，Pan Z W，F(xiàn)en T M，et al.Effects of matrine on the rapid component of delayed rectifier potassium current in ischemic ventricular myocytes［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(3):322－6.

［2］成 揚(yáng)，平 鍵，許懷棟，等.氧化苦參堿黃芩苷組合物對(duì)HepG 2.2.2.15細(xì)胞乙肝病毒抗原表達(dá)的抑制作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(10):1258－63.

［2］Cheng Y，Ping J，Xu H D，et al.The inhibitory effect of oxymatrinebaicailin compound on hepatitis Bviral antigens secretion in HepG2.2.2.15 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(10):1258－63.

［3］張麗華，陳邦恩，潘明佳.苦參堿藥理作用研究進(jìn)展［J］.中草藥，2009，40(6):1000－3.

［3］Zhang L H，Chen B E，Pan M J.Research progress on pharmacological effects of matrine［J］.Chin Trad Herbal Drugs，2009，40(6):1000－3.

［4］申曉東，宋關(guān)斌，嚴(yán) 潤(rùn)，等.苦參堿和氧化苦參堿抗腫瘤作用的研究進(jìn)展［J］.重慶大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，28(6):125－8.

［4］Shen X D，Song G B，Yan R，et al.Research progress of matrine and oxymatirne in the anti-tumor mechanism［J］.J Chongqing Univ Nat Sci，2005，28(6):125－8.

［5］萬(wàn)旭英，羅 明，賀 平，吳孟超.苦參堿和氧化苦參堿體外對(duì)人肝癌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(7):977－9.

［5］Wan X Y，Luo M，He P，Wu M C.Effect of Matrine and Oxymatrine on induction of differentiation of human hepatonm carcinoma cell linein vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(7):977－9.

［6］郭啟帥，黃 曦，李少林.苦參堿誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(8):1104－7.

［6］Guo Q S，Huang X，Li S L.Effect of Matrine on apoptosis of human ovarian cancer cell line SKOV3 and its mechanism［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(8):1104－7.

［7］Lubet R A，Steele V E，Juliana M M，Grubbs C J.Screening agents for preventive efficacy in a bladder cancer model:study design，end points，and gefitinib and naproxen efficacy［J］.J Urol，2010，183(4):1598－603.

［8］Taylor J A 3rd，Ristau B，Bonnemaison M，et al.Regulation of the prostaglandin pathway during development of invasive bladder cancer in mice［J］.Prostaglandins Other Lipid Mediat，2009，88(1－2):36－41.

［9］Shi Y，Cui L，Dai G，et al.Elevated prostaglandin E2 level via cPLA2-COX-2-mPGES-1 pathway involved in bladder carcinogenesis induced by terephthalic acid-calculi in Wistar rats［J］.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2006，74(5):309－15.

［10］Kitayama W，Denda A，Okajima E，et al.Increased expression of cyclooxygenase-2 protein in rat urinary bladder tumors induced by N-butyl-N-(4-hyroxybutyl)nitrosamine［J］.Carcinogenesis，1999，20(12):2305－10.

［11］Hammam O A，Aziz A A，Roshdy M S，Abdel Hadi A M.Possible role of cyclooxygenase-2 in schistosomal and non-schistosomal-associated bladder cancer［J］.Medscape J Med，2008，10(3):60.

［12］Grubbs C J，Lubet R A，Koki A T，et al.Celecoxib inhibits N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine-induced urinary bladder cancers in male B6D2F1 mice and female Fischer-344 rats［J］.Cancer Res，2000，60(20):5599－602.

［13］Castelao J E，Yuan J M，Gago-Dominguez M，et al.Non-steroidal anti-inflammatory drugs and bladder cancer prevention［J］.Br J Cancer，2000，82(7):1364－9.

［14］李 春，鄒桂華，彭瑞元，等.塞來(lái)昔布抑制SD大鼠膀胱癌作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2008，15(14):1061－3.

［14］Li C，Zou G H，Peng R Y，et al.Inhibition effect of celecoxib on SD mice bladder cancer［J］.Chin J Cancer Prev Treat，2008，15(14):1061－3.