李婷婷，高麗昌，唐 祿，張 健，李富勇，李海燕，王曉杰，，李校堃

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林長春 130000;2.溫州醫(yī)學院藥學院，浙江 溫 州 325035;3.浙江格魯斯特生物科技有限公司，浙江 溫州 325000)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指胰島素的靶組織對內(nèi)源性或外源性胰島素的敏感性和反應性降低，導致生理劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常的生理效應。肝臟是胰島素作用的靶器官之一，是胰島素耐受產(chǎn)生的主要部位。建立胰島素肝細胞抵抗模型，對于研究胰島素肝臟抵抗機制、篩選胰島素增敏劑具有重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，成纖維生長因子-21(FGF-21)是一種新的代謝調(diào)節(jié)因子，是一種不依賴胰島素信號通路調(diào)節(jié)血糖的細胞因子［1］，F(xiàn)GF-21主要在肝臟中特異性表達，其生物學功能主要體現(xiàn)在糖脂代謝調(diào)控方面。在動物實驗中，F(xiàn)GF-21已被證實能夠降低血糖、血脂，抑制胰高血糖素分泌，促進胰島素分泌，降低胰島素使用濃度［2］，有效改善 IR［3］，但是其改善IR作用機制尚不十分清楚。本實驗用超生理濃度的胰島素刺激人肝細胞(HL-7702)，建立IR細胞模型［4－7］。檢測葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 GLUT1和 ERK1/2信號磷酸化表達水平。結果表明，在細胞形成抵抗的情況下，F(xiàn)GF-21可以通過促進GLUT1的表達來促使細胞攝取葡萄糖，此外，F(xiàn)GF-21與胰島素產(chǎn)生協(xié)同作用，F(xiàn)GF-21改善IR可能與ERK1/2信號途徑有關。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系及藥品 重組人成纖維細胞生長因子-21凍干粉(浙江省生物制藥重點實驗室制備);人肝細胞系HL-7702(中國科學院細胞庫)。

1.1.2 主要試劑及儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo CELLBB15);細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extra cellular signal-regulatedkinase1/2，ERK1/2)抑 制 劑PD98059、ERK1/2抗體、ERK1/2磷酸化抗體(cell signaling technology);辣根酶標記山羊抗兔IgG(中杉金橋);Bradford蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學顯影液(碧云天);地塞米松(Sigma);胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone)、二甲基亞砜DMSO(Gibco)，重組人胰島素(萬邦醫(yī)藥)，葡萄糖檢測試劑盒(長春匯力)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HL-7702細胞用含20%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，細胞融合度達到80%左右，用0.25%的胰蛋白酶消化，備用。

1.2.2 FGF-21誘導HL-7702細胞葡萄糖吸收試驗

取對數(shù)生長期的HL-7702細胞接種于24孔板中，每孔細胞濃度為 5×107·L－1，每孔體積為 600 μl，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，換含1%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，加入1%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的濃度為 200 mg·L－1的 FGF-21，每孔 600 μl，做3個復孔，依次2倍梯度稀釋，共做7個稀釋度。24 h后用葡萄糖氧化酶(GOD-POD)法檢測培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，以未接種細胞空白復孔的葡萄糖均值做參比，測定各孔葡萄糖含量。根據(jù)公式:葡萄糖消耗/%=(空白對照組葡萄糖含量－樣品組葡萄糖含量)/空白對照組葡萄糖含量×100%。

1.2.3 FGF-21與胰島素合用測試HL-7702細胞葡萄糖吸收 24孔板中HL7702細胞用含1%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基饑餓24 h。GOD-POD法檢測不同濃度胰島素組及不同濃度胰島素與25 mg·L－1FGF-21聯(lián)合用藥組對HL-7702細胞的葡萄糖吸收作用。

1.2.4 胰島素抵抗HL-7702細胞模型的建立 參考文獻方法［4］，取對數(shù)生長期HL-7702細胞，接種在24孔板內(nèi)，待細胞貼壁后，加入含有34.4 μmol·L－1的重組人胰島素和 2 μmol·L－1地塞米松的10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基600 μl，共同孵育72 h。設置不加誘導劑的空白對照組。模型建成后，加入含1 μmol·L－1胰島素的饑餓培養(yǎng)基檢測葡萄糖吸收，鑒別模型是否成立。

1.2.5 FGF-21對胰島素抵抗HL-7702細胞葡萄糖吸收測試 設計4個測試組，分別是模型對照組，模型 1 μmol·L－1胰島素組，模型 50 mg·L－1FGF-21給藥組，模型FGF-21與胰島素聯(lián)合用藥組。IR模型細胞經(jīng)各組樣品誘導24 h后，用GOD-POD法檢測培養(yǎng)液中的葡萄糖含量變化。

1.2.6 Western blot檢測 GULT1 表達 50 mg·L－1FGF-21 處理 HL-7702 細胞6、24、48 h，1 μmol·L－1胰島素處理 HL-7702細胞6、24 h，用 PBS沖洗3遍，6孔板每孔加入100 μl細胞裂解液，冰上裂解10 min，收集細胞至 EP 管，4℃、12 000 r·min－1，離心15 min，取上清，根據(jù)蛋白含量測定上樣量。10%SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，然后將凝膠中的蛋白通過電轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉2 h，TBST緩沖液振蕩洗滌3次，每次6 min，加入一抗過夜(4℃)，TBST緩沖液振蕩洗滌3次，每次6 min，加入二抗，TBST緩沖液振蕩洗滌3次，每次6 min，ECL化學顯影，凝膠成像儀曝光顯影，觀察結果。

1.2.7 Western blot檢測ERK1/2磷酸化水平 檢測不同處理中ERK1/2磷酸化表達變化。參照步驟“1.2.5”設計8 個測試組，分別是對照組，1 μmol·L－1胰島素組，50 mg·L－1FGF-21 給藥組，F(xiàn)GF-21與胰島素聯(lián)合用藥組，模型對照組，模型1 μmol·L－1胰島素組，模型 50 mg·L－1FGF-21 給藥組，模型FGF-21與胰島素聯(lián)合用藥組。選用6 h作為時間點取樣。之后樣品的處理參照步驟“1.2.6”。

檢測ERK1/2阻斷劑PD98059處理后ERK1/2磷酸化表達變化。參照步驟“1.2.5”設計3個測試組，分別是對照組，50 mg·L－1FGF-21給藥組，20 mmol·L－1PD98059處理1 h后 FGF-21用藥組，之后樣品的處理參照步驟“1.2.6”。

1.3 統(tǒng)計分析 上述實驗均至少重復3次，取其均值。定量數(shù)據(jù)以±s表示，采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析。兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)采用單因素方差分析，組間比較采用Two-way ANOVA檢驗。

2 結果

2.1 不同濃度FGF-21對HL-7702細胞葡萄糖吸收試驗 FGF-21處理HL-7702細胞后，在3.1 mg·L－1～100 mg·L－1間 FGF-21 促進 HL-7702 細胞葡萄糖的吸收且呈現(xiàn)劑量－效應關系，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，見Fig 1。

Fig 1 The effects of FGF-21 on HL-7702 cells in glucose uptake assay

2.2 FGF-21與胰島素的協(xié)同作用 25 mg·L－1FGF-21 分別與 0.1 μmol·L－1和 1 μmol·L－1的胰島素聯(lián)合用藥后，葡萄糖吸收量增加，兩者對葡萄糖吸收作用有累加效果。兩組間比較采用Two-way ANOVA檢驗，P＜0.05，差異有顯著性(Fig 2)。

Fig 2 The effects of insulin and insulin combined with 25 mg·L－1FGF-21 of glucose uptake assay on HL-7702 cells

2.3 胰島素抵抗模型的建立 選用1 μmol·L－1或 2 μmol·L－1Dex 與 34.4 μmol·L－1胰島素聯(lián)合誘導HL-7702細胞，誘導3 d，檢測葡萄糖吸收。非胰島素抵抗模型組，HL-7702細胞經(jīng)Insulin刺激24 h后與未刺激組葡萄糖吸收量差異有顯著性(P＜0.05)。模型組中，Insulin刺激24 h后與未刺激組葡萄糖吸收量差異無顯著性(P＞0.05)。結果顯示細胞對胰島素敏感性降低，說明胰島素抵抗模型成功。2 μmol·L－1Dex 和 34.4 μmol·L－1胰島素聯(lián)合誘導組葡萄糖吸收率最低(Fig 3)，因此，選用這個組合進行胰島素抵抗模型的建立。

Fig 3 IR model established by high level insulin combined with dexamethasone on HL-7702 liver cells

2.4 FGF-21改善HL-7702細胞IR模型的葡萄糖吸收 分別用胰島素、FGF-21及胰島素和FGF-21聯(lián)合用藥組處理HL-7702 IR模型細胞24 h后，經(jīng)微量化的GOD-POD法檢測培養(yǎng)基中葡萄糖含量，與無細胞的培養(yǎng)基中葡萄糖含量相減計算出細胞的葡萄糖消耗率，進行統(tǒng)計學分析。結果表明，胰島素刺激的模型細胞的葡萄糖消耗與未刺激的對照細胞葡萄糖消耗率無差異，表明IR模型建立成功。而用FGF-21刺激的模型細胞與對照組相比，葡萄糖的消耗明顯增加，統(tǒng)計學處理顯示差異有顯著性(P＜0.05)。FGF-21和胰島素聯(lián)合用藥組與對照組相比，葡萄糖的攝取利用顯著增加，統(tǒng)計學處理顯示差異有顯著性(P＜0.05)，F(xiàn)GF-21和胰島素聯(lián)合用藥組與FGF-21單獨給藥組相比，統(tǒng)計學處理顯示差異無顯著性(P＞0.05，F(xiàn)ig 4)。

Fig 4 The effects of FGF-21 on IR model HL-7702 human liver cells in glucose uptake assay

2.5 FGF-21增加HL-7702細胞GLUT1的表達葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)是哺乳動物轉(zhuǎn)運葡萄糖的主要載體，它調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取，對葡萄糖分子具有很高的親和力。50 mg·L－1FGF-21孵育HL-7702細胞6、24、48 h，GLUT1表達增強(P＜0.05);胰島素孵育HL-7702細胞6、24 h GLUT1表達量未見增加(Fig 5)。在胰島素抵抗模型中，F(xiàn)GF-21孵育24 h后，GLUT1的表達量與未處理的細胞相比明顯增加。而胰島素處理的細胞GLUT1的表達未見增加，F(xiàn)GF-21與胰島素聯(lián)合給藥組，GLUT1表達量高于FGF-21單獨給藥組(Fig 6)?？梢姡诩毎纬梢葝u素抵抗的情況下，F(xiàn)GF-21可以通過增加細胞GLUT1的表達，從而促進葡萄糖的吸收。

Fig 5 FGF-21 affects GLUT1 protein levels in HL-7702 liver cells(immunoblot)

Fig 6 FGF-21 affects GLUT1 protein levels in IR model of HL-7702 liver cells(immunoblot)

2.6 FGF-21增加HL-7702細胞ERK磷酸化表達

50 mg·L－1FGF-21 孵 育 6 h，HL-7702 細 胞ERK1/2磷酸化增強，是空白對照的16倍(P＜0.05);胰島素抵抗狀態(tài)下，F(xiàn)GF-21仍促進ERK1/2磷酸化增強，是模型對照的1.7倍(P＜0.05)，胰島素孵育后ERK1/2磷酸化下降，F(xiàn)GF-21和胰島素共同存在時上調(diào)ERK1/2磷酸化表達水平(Fig 7)。

Fig 7 FGF-21 induces phosphorylation of ERK1/2 on HL-7702 liver cells

胰島素抵抗狀態(tài)下，20 mmol·L－1細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2的阻斷劑PD98059處理1 h后，F(xiàn)GF-21促進ERK1/2磷酸化，與FGF-21處理的相比減弱(P＜0.05)，見 Fig 8。

3 討論

胰島素抵抗是2型糖尿病的重要發(fā)病機制之一，貫穿著2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展全過程，是導致糖尿病各種并發(fā)癥的“動力”根源［8］。因此，尋找有效改善胰島素抵抗藥物一直是2型糖尿病治療的研究熱點［9］。FGF-21是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的代謝調(diào)節(jié)因子，是一種不依賴胰島素調(diào)節(jié)血糖的細胞因子［1］。FGF-21具有高效并持續(xù)調(diào)節(jié)機體糖脂代謝，提高胰島細胞功能和數(shù)量，改善脂蛋白譜等功能，并且能夠有效地改善胰島素抵抗［3，10］。

Fig 8 PD98059(the inhibitor of ERK1/2)can blocks FGF-induced ERK phosphorylation

高濃度胰島素誘導的胰島素抵抗其最直觀的判定特征就是葡萄糖的攝取利用，IR模型細胞葡萄糖攝取率與正常細胞相比明顯降低，說明IR模型的建立成功［4］。糖皮質(zhì)激素和胰島素抵抗之間存在復雜的相互關系［11－12］，是引起胰島素抵抗的重要激素［13－14］。動物實驗中也常利用大劑量糖皮質(zhì)激素建立糖尿病動物模型［11］。本試驗借鑒已成熟技術，用高濃度胰島素和地塞米松誘導HL-7702細胞胰島素抵抗，模擬體內(nèi)復雜胰島素抵抗狀況，為研究胰島素抵抗機制奠定基礎。

經(jīng)高濃度胰島素和地塞米松誘導的HL-7702細胞，葡萄糖攝取能力明顯低于未誘導細胞，細胞對胰島素敏感性降低，胰島素抵抗細胞模型建立成功。在此基礎上進行FGF-21參與的葡萄糖消耗試驗，探討FGF-21在胰島素抵抗狀態(tài)下對HL-7702細胞糖吸收能力的影響及其機制，以期更進一步闡述FGF-21在人體上的藥理作用。實驗結果表明，在胰島素抵抗狀態(tài)下FGF-21能有效促進HL-7702細胞葡萄糖吸收。為了研究FGF-21促進模型細胞葡萄糖攝取的機制，本實驗通過Western blot檢測HL-7702細胞胰島素抵抗模型中 GLUT1的表達和MAPK途徑中ERK1/2的磷酸化表達。結果表明FGF-21增強GLUT1的表達水平，在胰島素抵抗狀態(tài)下FGF-21仍然明顯增強GLUT1的表達水平。由此我們可以推測，F(xiàn)GF21通過增強GLUT1的表達來改善肝細胞胰島素抵抗下葡萄糖的吸收。文獻［1］證明FGF-21是一種典型的可以促進MAPK活化的分子。本結果顯示胰島素抵抗模型中，F(xiàn)GF-21可提高ERK1/2的磷酸化水平，而PD98059(ERK1/2特異性抑制劑)可抑制FGF-21的促ERK1/2磷酸化的效果。因此在胰島素抵抗模型中，F(xiàn)GF-21改善胰島素抵抗狀況時可能通過ERK1/2信號途徑。相信隨著研究的展開，更多地了解FGF-21與糖尿病的關系，將為糖尿病的治療開辟一條嶄新的途徑。

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