許 華，鄧淑琴，何 清，蘇本金，江海香，黃亞東

(暨南大學1.藥學院，2.中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及創(chuàng)新藥物研究廣東省高校重點實驗室，3.醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心，廣東廣州 510632)

堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)為成纖維細胞家族的重要成員之一，具有廣泛的生物學活性，可促進細胞增殖和分化，促進傷口的愈合，已在臨床用于燒傷、創(chuàng)傷等的治療。但該類藥物在臨床大劑量或長時間應用，特別是在育齡人群使用，是否會引起胚胎干細胞的異常分化而導致潛在的生殖發(fā)育毒性，令人擔憂。由于該類藥物自身的生物學特性和作用機制不同于常規(guī)的化合物，難以用傳統(tǒng)的檢測方法確定其可能出現(xiàn)生殖發(fā)育毒性。本實驗欲建立小鼠胚胎干細胞試驗(EST)模型，初步判斷bFGF是否具有發(fā)育毒性，為生長因子類藥物的安全用藥提供初步的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級昆明種小鼠，♀♂各半，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購自中山大學實驗動物中心，動物許可證號:SCXK(粵)2009-0011。

1.2 細胞系 BALB/c 3T3購自中山大學細胞庫，ES-D3由浙江大學朱丹燕教授惠贈。

1.3 主要試劑 bFGF，購自廣東南海朗泰制藥有限公司，批號C20110301;堿性磷酸酶試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)研究所;白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor;LIF)，貨號 ESG1106購自 Millipore公司;絲裂霉素C購自Roche公司;ES細胞培養(yǎng)基(含有 15%胎牛血清 FBS，0.1 mmol·L－1β-巰基乙醇，2 mmol·L－1L-谷氨酰胺，0.1 mmol·L－1丙酮酸鈉，1%青－鏈霉素，0.1 mmol·L－1非必需氨基酸NEAA和1 000 kU·L－1LIF)，高糖 DMEM 培養(yǎng)基(含10%FBS，1%青－鏈霉素)

1.4 方法

1.4.1 小鼠原代胚胎成纖維細胞的提?。?］取12.5～14.5 d的昆明種胎鼠，將軀干部分剪碎，采用胰酶多次消化的方法，取上層懸液并離心，收集細胞沉淀，即小鼠胚胎成纖維細胞，用高糖DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待細胞長至80%即可傳代。

1.4.2 飼養(yǎng)層的制備［2］取第2～4代的處于對數(shù)生長期的鼠胚胎成纖維細胞用10 mg·L－1的絲裂霉素C 37℃作用3 h抑制細胞的分裂，消化后接種于質(zhì)量濃度為0.1%明膠包被的新培養(yǎng)瓶中即制備成飼養(yǎng)層。

1.4.3 小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng) 將復蘇的ES-D3接種于制備的飼養(yǎng)層中，用ES細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天換液，每2～3天傳代至新的飼養(yǎng)層上。

1.4.4 小鼠胚胎干細胞未分化的鑒定 ESC通過形態(tài)學觀察、堿性磷酸酶染色及RT-PCR對ESC未分化基因Oct-4和Sox-2的表達這三方面的檢測對ESC進行鑒定。所用引物如Tab 1。

1.4.5 bFGF 對 ESC 和 3T3 的細胞毒性檢測［3］將處于對數(shù)生長期的ESC和3T3以1×104·L－1的密度分別接種到96孔板中，每孔50 μl，待細胞貼壁后，每孔加入不同濃度的bFGF的培養(yǎng)基150 μl(0、10、20、30、40、50、60、70 和 80 mg·L－1)繼續(xù)培養(yǎng)，同時設立陰性對照組，d 3、d 5進行更換新的含藥培養(yǎng)基，d 10時用MTT法檢測細胞活性，于波長570 nm處檢測其吸光度值，制成濃度－反應曲線，求出相對應的產(chǎn)生50%細胞毒性的受試物濃度，即IC50ESC和IC503T3。

Tab 1 Sequences of primers

1.4.6 bFGF對 ESC分化抑制試驗［4］用不含有LIF的ESC分化培養(yǎng)基制備成含不同濃度的bFGF的培養(yǎng)基(0、0.03、0.3、3 和 30 mg·L－1)，將差速貼壁所收集的ESC與上述濃度混勻后，以2.5×104·L－1的密度(每滴 30 μl，大約 750 個細胞)進行懸滴、懸浮、貼壁三步法培養(yǎng)。于d 10收集細胞進行RT-PCR檢測ECS中未分化基因Sox-2和管家基因GADPH的表達量，并進行灰度半定量分析，求出bFGF對ESC分化抑制率為50%時的作用濃度，即半數(shù)抑制濃度ID50ESC。

1.4.7 發(fā)育毒性的判斷 受試物發(fā)育毒性的計算公式和評價方法見文獻［5］。

1.5 數(shù)據(jù)處理 采用Image J分析軟件對RT-PCR凝膠圖像進行灰度半定量分析。采用SPSS統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 小鼠胚胎干細胞未分化的鑒定

2.1.1 形態(tài)學觀察 鏡下可觀察到生長在飼養(yǎng)層上的ESC呈克隆狀生長，類似圓形或島嶼狀，邊緣光滑清晰，集落中細胞密集，細胞界限不清。如Fig 1。

2.1.2 堿性磷酸酶染色 將生長在飼養(yǎng)層上的ESC經(jīng)NBT/BCIP染色工作液作用后，細胞克隆被染成藍色，說明ESC處于未分化狀態(tài)。如Fig 2。

2.1.3 未分化基因的表達 ESC和MEF提取所得的總RNA進行RT-PCR，并經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，ESC未分化基因Oct-4和Sox-2均有表達，表明實驗所用的ESC處于未分化狀態(tài)。如Fig 3。

2.2 bFGF對ESC和3T3的細胞存活率的影響MTT檢測結(jié)果顯示，隨著bFGF濃度的增加，ESC和3T3的增殖均受到明顯的抑制，并有一定的劑量依賴性;在同等濃度下，bFGF對ESC增殖的抑制作用強于3T3細胞，表明 ESC對 bFGF的敏感性高于3T3。應用GraphPad Prism5.0軟件處理數(shù)據(jù)，得出bFGF的IC50ESC和IC503T3分別為15.2 mg·L－1和 24.2 mg·L－1。如 Fig 4。

Fig 1 Embryonic stem cells cultured on mouse embryonic fibroblasts(×100)

Fig 2 Alkaline phosphatase staining of mouse embryonic stem cells(×200)

Fig 3 Expression of undifferentiated gene Sox-2 and Oct-4 in embryonic stem cells

Fig 4 Inhibitiory effect of different concentrations of bFGF on embryonic stem cells and 3T3 cells(±s，n=6)

2.3 bFGF對ESC分化的抑制作用 將PCR結(jié)果進行1%瓊脂糖凝膠電泳，如Fig 5所示，隨著bFGF作用濃度的提高，未分化基因Sox-2的表達量呈劑量依賴性增高，表明ESC分化受到抑制。通過灰度半定量分析，求出各受試物相對應的產(chǎn)生50%胚胎干細胞分化抑制作用的濃度ID50ESC為1.7 mg·L－1。

Fig 5 Expressions of Sox-2 after exposed to different concentrations of bFGF for 10 days

2.4 受試物發(fā)育毒性的判定結(jié)果 將上述所求得的IC503T3，IC50ESC和ID50ESC代入受試物發(fā)育毒性計算公式得到Ⅱ＞Ⅰ，且Ⅱ＞Ⅲ，則生長因子類藥物bFGF發(fā)育毒性為二級，即有弱胚胎毒性。

3 討論

歐洲替代試驗方法驗證中心(European Center for Validation Alternative Methods，ECVAM)推薦的EST模型可用于外來物胚胎發(fā)育毒性的評價。EST對受試物的檢測終點由2個部分組成，一為細胞毒性(用半數(shù)抑制濃度IC50表示)，二為胚胎毒性(用半數(shù)抑制分化濃度ID50表示)［6］。通過檢測受試物對ESC分化的影響(即ID50ESC)和對ESC與成纖維細胞BALB/c3T3的細胞毒性檢測結(jié)果(即IC50ESC和IC503T3)，按照ECVAM推薦的胚胎發(fā)育毒性評價公式計算，即可直接定性某一藥物的可能胚胎毒性［5］。ECVAM用EST對多種化合物檢測所得無胚胎毒性、低胚胎毒性和高胚胎毒性結(jié)果與體內(nèi)試驗的符合率分別為70%、82.5%和81.25%。并且在大約360種受試物中挑選出具有明確體內(nèi)胚胎發(fā)育毒性實驗數(shù)據(jù)的30種，使用EST進行胚胎發(fā)育毒性檢測，結(jié)果顯示與體內(nèi)結(jié)論的符合率達到82%，其中強胚胎毒性的符合率更達到100%［7］。

生長因子類，包括 aFGF、bFGF、EGF、NGF 等，是體內(nèi)廣泛存在的具有促進組織分裂增殖作用的一大類生物因子。目前應用基因工程技術(shù)使得這些生長因子可大量生產(chǎn)成藥物用于臨床。但該類因子在較大劑量和較長時間應用是否具有某些潛在的毒性一直是人們爭論的問題。如鄭海英等［8］研究發(fā)現(xiàn)，添加一定量表皮生長因子EGF有助于減少胚胎細胞凋亡和壞死數(shù)目，但當EGF濃度達0.1 mg·L－1時，它不僅抑制了胚胎的正常發(fā)育，還增加了胚胎細胞凋亡和壞死率，并對胚胎細胞產(chǎn)生損傷和毒害作用;Tichelaar等［9］發(fā)現(xiàn)FGF-7在鼠肺上皮的過高表達又可引起胚胎期鼠肺上皮的異常發(fā)育，其組織學改變類似肺囊腺瘤，正常的肺泡結(jié)構(gòu)消失，最終導致胚胎期小鼠死亡;喻靜等［10］用大鼠原代睪丸支持細胞進行aFGF生殖毒性研究，當培養(yǎng)液中aFGF達到較高濃度時，可誘發(fā)細胞衰老、引發(fā)細胞結(jié)構(gòu)和功能的改變、與細胞損傷相關(guān)的c-fos、c-jun和c-myb基因表達也明顯增加。除此之外，還有為避免野生型生長因子可能存在的毒性而對其進行改構(gòu)的研究［11－12］。因此，該類藥物的生物學效應即促細胞增殖和分化作用，是否在大劑量使用時會引起胚胎發(fā)育毒性及致畸性，值得關(guān)注。

已有報道外源性aFGF可抑制ESC向骨骼細胞的定向分化而促使ESC向心肌細胞的定向分化，而bFGF卻促進ESC向骨骼肌細胞的分化［13］。當某一FGF大劑量單獨使用時對組織分化是否會有異常影響或不平衡分化，未見報道。而誘導分化的不均衡可能會帶來胚胎先天異常的發(fā)生［14］。本實驗室采用未分化基因Sox-2作為指標進行藥物毒性的評價已得到有效性的驗證［4］，因此本文用EST模型，按照ECVAM推薦的體外胚胎發(fā)育毒性評價方法，采用未分化基因Sox-2表達量作為衡量分化程度的指標，對bFGF的胚胎毒性進行了檢測和判斷。結(jié)果表明bFGF具有弱胚胎毒性。細胞形態(tài)學觀察，當bFGF的作用濃度高于30 mg·L－1時3T3和ESC的形態(tài)均有明顯的變化，可見細胞密度明顯減少，細胞中出現(xiàn)空泡并有所萎縮，并隨著作用濃度的提高，細胞幾乎全崩解成黑色碎片。ESC三步法培養(yǎng)結(jié)果顯示，bFGF低劑量組比未加藥組和高劑量組出現(xiàn)心肌搏動的時間要早，可能bFGF在低濃度下促進了ESC向心肌細胞方向分化，而高劑量bFGF的促分化作用消失甚至出現(xiàn)毒性。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)，當bFGF作用濃度大于50 mg·L－1時無法形成完整的擬胚體。

總之，本實驗按照ECVAM推薦的體外胚胎發(fā)育毒性評價方法對bFGF進行了初步的發(fā)育毒性評價，結(jié)論是bFGF具有弱胚胎毒性。而不同濃度bFGF作用ESC在發(fā)育過程中內(nèi)、中、外三胚層的各個基因以及蛋白的變化還需要進一步研究，從而更全面的了解bFGF在整個胚胎發(fā)育過程中對不同胚層發(fā)育的影響，以期為臨床用藥提供參考。

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