吳饒平，熊 偉，歐曉艷，劉 晗，邱淑怡，李桂林，徐昌水，劉雙梅，梁尚棟，高 云

(南昌大學1.基礎醫(yī)學院生理學教研室、2.附屬口腔醫(yī)院預防科，江西南昌 330006)

三叉神經(jīng)痛(trigeminal neuralgia，TN)是一種病因不明，單側(cè)撕裂性或電擊性陣痛的慢性疼痛綜合癥，臨床上發(fā)病率較高，但治療困難，對患者及家屬的生活造成極大的痛苦［1－2］。目前雖然治療藥物較多，但有效而副作用小的藥很少，而且容易發(fā)生耐藥［3－4］。因此我們有必要尋找TN治療新的更有效的方法。目前大量研究證實，ATP及其類似物作用的P2X嘌呤受體在傷害性感受信號傳遞過程中起著重要作用［5－8］，其中 P2X2/3受體和痛覺傳遞關(guān)系最為密切，且可能參與三叉神經(jīng)痛的發(fā)生。大黃素(emodin)是中藥大黃的主要有效成分，化學名為1，3，8-三羥基-6 甲基蒽醌(1，3，8-trihydroxy-6methy lanthraquinone)，分子式為 C15H10O5，分子量為270.23，化學結(jié)構(gòu)屬于羥基蒽醌類，其藥理作用主要集中在抑制細胞增殖、抗炎、抑制肝臟和腎臟纖維化等方面。有實驗結(jié)果顯示大黃素通過多種途徑產(chǎn)生抗炎作用［9］。永久性的神經(jīng)病理痛有神經(jīng)炎性及神經(jīng)免疫性作用［10］。所以大黃素可能通過其抗炎及免疫抑制作用緩解外周神經(jīng)疼痛［11］。目前還不清楚大黃素是否影響慢性疼痛的信息傳遞。ATP是神經(jīng)調(diào)質(zhì)，P2X2/3參與神經(jīng)病理痛中的傷害感受傳導，本研究試圖闡明在P2X2/3受體介導的三叉神經(jīng)痛中，大黃素對痛覺傳遞的作用。

1 材料與方法

1.1 動物和分組 ♂ SD大鼠，220～250 g，40只，江西中醫(yī)學院實驗動物科學部提供，合格證號:JZDWN2:2011-0316。將大鼠隨機分為4組，每組10只。Ⅰ組為0.5%羧甲基纖維素鈉溶液注射對照組(Control)、Ⅱ組為假手術(shù)組(Sham)、Ⅲ組為三叉神經(jīng)痛模型組(TN)、Ⅳ組為TN模型+大黃素干預組(TN+E)。Ⅰ組每天按5 ml·kg－1劑量腹腔注射0.5%的羧甲基纖維素鈉至實驗結(jié)束;Ⅱ組切開皮膚暴露眶下神經(jīng)，不結(jié)扎神經(jīng)，即縫合皮膚;Ⅳ組術(shù)后d 1開始每天每只大鼠腹腔注射50 mg·kg－1大黃素至實驗結(jié)束，大黃素用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶解。

1.2 藥品和試劑 大黃素(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)，10%水合氯醛(上海新亞藥業(yè)有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)，免疫組化SP-9001試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)，P2X2、P2X3原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，P2X2、P2X3抗體(Millipore公司)，β-actin、P2X2、P2X3引物(北京生物工程有限公司)。

1.3 三叉神經(jīng)痛模型的建立 參照文獻［12］10%水合氯醛按4 ml·kg－1劑量對大鼠進行腹腔內(nèi)注射麻醉。大鼠麻醉后取俯臥位，頭部及四肢固定。備皮、消毒、鋪巾。在手術(shù)顯微鏡下做眉弓上弧形切口，顯露顱骨額骨和鼻骨，暴露眼眶，沿眶上緣將眶內(nèi)容物用神經(jīng)剝離子撥開，暴露位于眶底部內(nèi)側(cè)的眶下神經(jīng)，在眶內(nèi)從近端仔細分離眶下神經(jīng)至遠端的眶下孔。用兩根鉻腸線(5-0)間距約2 mm結(jié)扎眶下神經(jīng)，力度適中。壓迫標準:在顯微鏡下可見結(jié)扎線使神經(jīng)的直徑略微變細，但不能完全阻斷其傳導且神經(jīng)外膜的血液循環(huán)必須通暢?？p合創(chuàng)口，待動物清醒后給予一般飼養(yǎng)。

1.4 三叉神經(jīng)痛大鼠機械痛敏測定 將各組大鼠分別于手術(shù)前 1 d，術(shù)后 1、3、5、7、9、11、13 d 行機械痛敏閾值測試(測定時間恒定于每日10:00～14:00，室溫維持在22℃ ±0.5℃)。機械痛敏閾值是由BME-403 Von Frey細絲(購自中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所)來測定，折力分別為:0.13、0.20、0.33、0.60、1.30、3.60、5.00、7.30、9.90、20.1 g，從最小折力開始，刺激部位為眶下神經(jīng)在面部感覺支配區(qū)域—圍繞鼻區(qū)中央的觸須部位及周圍有毛皮膚。手持刺激棒緩慢接近大鼠，先在手術(shù)的對側(cè)刺激3下，使細絲彎曲，再在手術(shù)側(cè)刺激3下，每一強度的細絲共刺激6次。在此過程中，細絲的強度由低到高依次遞增。動物的陽性反應包括:①經(jīng)刺激即表現(xiàn)為快速的后退動作，大鼠為避免面部進一步被接觸，倦縮身子向籠壁靠攏，或?qū)㈩^面部藏在身下，躲避刺激物。② 攻擊行為，大鼠亦可表現(xiàn)出快速抓咬刺激物，做出攻擊動作。③非對稱性的面部搔抓，表現(xiàn)為至少連續(xù)3次搔抓面部刺激區(qū)域的動作，通常合并后退動作。出現(xiàn)以上3種反應中任意1項或l項以上即認為是刺激實驗陽性，使大鼠產(chǎn)生陽性反應細絲強度最小值即為疼痛反應閾值。④如果刺激強度為20.1 g時，大鼠未出現(xiàn)以上任何一種反應，疼痛閾值定為20.1 g。觀察各組大鼠手術(shù)前后對于不同強度細絲刺激產(chǎn)生痛覺反應闞值的變化，與對照組比較，進行統(tǒng)計學分析。

1.5 大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X2/3受體的表達測定

1.5.1 原位雜交 大鼠迅速斷頭，取手術(shù)側(cè)TG，原位雜交用PBS沖洗后用原位雜交用4%多聚甲醛固定24 h，然后浸入原位雜交用30%蔗糖脫水24 h，期間換糖水3次，4℃冰箱過夜。恒冷切片機將TG切成15 μm厚的薄片，烤片37℃，2 h，－20℃保存。原位雜交過程按說明書完成。顯微鏡下拍照，實驗結(jié)果用Image tool圖像分析系統(tǒng)觀察分析光密度。

1.5.2 RT-PCR 按說明書完成總RNA的提取和cDNA的合成。本研究選用β-actin作為內(nèi)參，引物序列如下:

Primer P2X2(產(chǎn)物長度為273 bp)，S:5'-CTGCCTCCTCAGGCTACAACTTCA-3';A:5'-GAGTACGCACCTTGTCGAACTTCT-3'。Primer P2X3(產(chǎn)物長度為 519 bp)，S:5'-CAACTTCAGGTTTGCCAAA-3';A:5'-TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3'。Primer β-actin(產(chǎn)物長度為240 bp)，S:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3';A:5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'。

P2X2、P2X3和 β-actin擴增體系分別如下:DEPC 水 9.5 μl，cDNA 1 μl，上下游引物各 1 μl，2 ×Taq酶12.5 μl。PCR 反應條件:94℃ 3 min;94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 45 s，共 35 個循環(huán);72℃ 5 min。各組取5 μl擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果、拍照，采用凝膠成像系統(tǒng)讀取分析目的電泳條帶，以各組β-actin為內(nèi)參將其相應組P2X2、P2X3的灰度值標化后進行比較。

1.5.3 免疫組織化學 大鼠迅速斷頭，取手術(shù)側(cè)TG，用PBS沖洗后，4%多聚甲醛固定24 h，然后將組織浸入30%蔗糖脫水24 h，中途換糖水3次，4℃冰箱過夜。恒冷切片機將TG切成15 μm厚的薄片，烤片37℃，2 h，－20℃保存。二步法免疫組織化學染色，DAB顯色。顯微鏡下拍照，用Image tool圖像分析系統(tǒng)觀察分析光密度。

1.5.4 免疫熒光 前期準備同免疫組化，免疫熒光過程按說明書完成。熒光顯微鏡下拍照，實驗結(jié)果用Image tool圖像分析系統(tǒng)觀察分析光密度。

1.5.5 Western blot 將手術(shù)側(cè)大鼠TG置于2 ml勻漿器中球狀部位，加300 μl去污劑裂解液(含10%PMSF)于勻漿器中進行冰上勻漿，充分裂解后移至1.5 ml離心管中，以12 000 r·min－1于 4℃ 離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，免疫學檢測，光密度分析。通過Image tool圖像分析軟件讀取目的條帶在X光膠片上測得的光密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標化其相應組P2X2、P2X3的蛋白表達量。

1.6 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各實驗組數(shù)據(jù)均以±s表示，各組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠機械痛敏閾值測定 手術(shù)前Ⅰ組(Control組)、Ⅱ組(Sham組)、Ⅲ組(TN組)、Ⅳ組(TN+E)之間相比大鼠手術(shù)側(cè)眶下神經(jīng)面部感覺區(qū)域機械痛閾值差異沒有顯著性(P＞0.05)。術(shù)后2周內(nèi)，Ⅲ組(TN模型組)的機械痛反射閾值在雙側(cè)都有所下降，手術(shù)側(cè)下降更為明顯。術(shù)后d 1開始，Ⅲ組的手術(shù)側(cè)機械痛反射閾值與Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組比較降低(P＜0.01)，并從術(shù)后d 3開始明顯并一直持續(xù)到14 d(P＜0.01)。從術(shù)后d 1開始，Ⅳ組的手術(shù)側(cè)機械痛反射閾值和Ⅰ、Ⅱ組比較有所降低(P＜0.01)，從d 11開始無差異，但從術(shù)后d 5開始與Ⅲ組比較明顯增加(P＜0.05)，見Fig 1。

Fig 1 Effect of emodin on the mechanical withdrawal threshold of TN rats(n=10)

Average optical density of P2X3mRNA in the four groups(n=10).##P ＜0.01 vs TN.(arrows indicated the immunostaining neurons;scale bars，100 μm)

Fig 2B Effects of emodin on the expression of P2X2receptor mRNA in trigeminal ganglion of each group by in situ hybridization on postoperative d 14

2.2 大鼠TG中P2X2/3受體表達的測定

2.2.1 原位雜交 術(shù)后14 d，原位雜交測定大鼠TG切片中P2X2/3受體mRNA的表達。于每只大鼠TG切片中隔5張取1張切片，用圖像分析系統(tǒng)軟件分析P2X2/3陽性神經(jīng)元的光密度變化。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組P2X3陽性神經(jīng)元的平均光密度分別為:0.2311±0.0204、0.2355 ±0.0216、0.5801 ±0.0422、0.3233±0.035。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組P2X2陽性神經(jīng)元的平均光密度分別為:0.2551±0.0236、0.2678 ± 0.0253、0.5676 ± 0.0463、0.2933±0.0315。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組之間P2X2/3受體表達差異無顯著性(P＞0.05);Ⅲ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅰ組、Ⅱ組明顯增加(P＜0.01);Ⅳ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅲ組低(P＜0.01)，見Fig 2。

2.2.2 RT-PCR 術(shù)后14 d，PCR方法測定各組三叉神經(jīng)節(jié)中P2X2/3受體mRNA的表達。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)軟件分析后，以β-actin為內(nèi)參將P2X3的灰度值進行標化，結(jié)果如下:Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組分別為:0.3081 ±0.0162、0.3111 ±0.0110、0.4979 ±0.0271、0.3359 ±0.0125。以β-actin為內(nèi)參將P2X2的灰度值進行標化，結(jié)果如下:0.3055±0.0167、0.3150±0.0132、0.6266 ±0.0199、0.3445 ±0.0131。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組之間P2X2/3受體表達差異無顯著性(P＞0.05);Ⅲ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅰ組、Ⅱ組明顯增加(P＜0.01);Ⅳ組 TG中P2X2/3受體的表達較Ⅲ組低(P＜0.01)，見Fig 3。

Fig 3 Effects of emodin on the expression of P2X3receptor mRNA in TG of each group by RT-PCR on postoperative d 14(n=10)

2.2.3 免疫組織化學 術(shù)后14 d，免疫組化測定大鼠TG切片中P2X2/3受體的表達。于每只大鼠TG切片中隔5張取1張切片，用圖像分析系統(tǒng)軟件分析P2X2/3陽性神經(jīng)元的光密度變化。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組P2X3陽性神經(jīng)元的平均光密度分別為:0.1668±0.0246、0.1702 ±0.0197、0.3290 ±0.0283、0.1847±0.0210。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組P2X2陽性神經(jīng)元的平均光密度分別為:0.1549±0.0183、0.1657 ± 0.0143、0.3548 ± 0.0243、0.1808±0.0228。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組之間P2X2/3受體表達差異無顯著性(P＞0.05);Ⅲ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅰ組、Ⅱ組明顯增加(P＜0.01);Ⅳ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅲ組低(P＜0.01)，見Fig 4。

Fig 4A Effects of emodin on the expression of P2X3receptor protein in TG of each group by immunohistochemistry on postoperative d 14(n=10)

Fig 4B Effects of emodin on the expression of P2X2receptor protein in trigeminal ganglion of each group by immunohistochemistry on postoperative d 14(n=10)

2.2.4 免疫熒光 術(shù)后14 d，免疫熒光雙標測定大鼠TG切片中P2X3、P2X2受體的表達。結(jié)果顯示，P2X3和P2X2共同表達于三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞上，且Ⅲ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組增加，見Fig 5。

2.2.5 蛋白印跡 術(shù)后14 d，Western blot方法測定各組三叉神經(jīng)節(jié)中P2X2/3受體蛋白的表達。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)軟件分析后，以β-actin為內(nèi)參將P2X3的光密度值進行標化，結(jié)果如下:Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組分別為:0.1523±0.0163、0.1632±0.0184、0.6666±0.0482、0.2319±0.0284。以 β-actin為內(nèi)參將P2X2的光密度值進行標化，結(jié)果如下:0.1879± 0.0174、0.1893 ± 0.0187、0.5362 ± 0.0429、0.3246±0.0262。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組之間P2X2/3受體表達差異無顯著性(P＞0.05);Ⅲ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅰ組、Ⅱ組明顯增加(P＜0.01);Ⅳ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅲ組低(P＜0.01)，見Fig 6。

Fig 5 Colocation of P2X2and P2X3in TG by double-label immunofluorescence on postoperative d 14

3 討論

嘌呤受體分為P1和P2受體，ATP及其類似物作用于P2受體。P2受體分為配體門控性離子通道型受體(P2X受體)和G蛋白偶聯(lián)型受體(P2Y受體)［13］。大量研究顯示嘌呤受體中的P2X2/3受體參與疼痛的發(fā)病過程［14－16］。三叉神經(jīng)節(jié)中含有大量與外周痛覺傳導有關(guān)的中小型神經(jīng)細胞，并有P2X2/3受體的表達［17］，但目前 P2X2/3受體在三叉神經(jīng)痛的痛覺傳導過程中所起的作用還不是很清楚。

本實驗應用大鼠三叉神經(jīng)痛模型研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后d 1開始，TN模型組的機械痛敏閾值降低，并從術(shù)后d 3開始更為明顯并一直持續(xù)到d 14。應用RT-PCR和原位雜交技術(shù)檢測TN大鼠手術(shù)側(cè)TG中P2X2/3受體mRNA的表達，結(jié)果顯示TN模型大鼠TG中P2X2/3受體mRNA的表達明顯升高，免疫組化和蛋白印跡技術(shù)檢測大鼠手術(shù)側(cè)TG中P2X2/3受體蛋白的表達，結(jié)果與其在mRNA水平的表達也基本一致。這些結(jié)果提示，P2X2/3受體蛋白和 mRNA的表達異常與三叉神經(jīng)痛密切相關(guān)。我們推測與外周痛覺傳遞有關(guān)的TG神經(jīng)元可能是通過激動P2X2/3受體，參與痛覺的調(diào)制。慢性壓迫損傷眶下神經(jīng)造成的三叉神經(jīng)節(jié)P2X2/3受體免疫反應陽性數(shù)量增加，有可能是由于在神經(jīng)損傷位點，異位嘌呤能神經(jīng)敏感性增強，從而導致P2X受體上調(diào)所致。

Fig 6A Effects of emodin on the expression of P2X3receptor protein in TG of each group by Western blot on postoperative d 14(n=10)

Fig 6B Effects of emodin on the expression of P2X2receptor protein in trigeminal ganglion of each group by Western blot on postoperative d 14(n=10)

近年大量研究顯示嘌呤受體中的P2受體是參與痛覺傳遞的重要受體［18－19］，嘌呤受體可能成為疼痛治療的新靶點［20］。我們實驗室以往的實驗也顯示能特異性拮抗P2X3受體的川芎嗪、阿魏酸鈉等藥物對坐骨神經(jīng)壓迫損傷神經(jīng)病理痛大鼠的機械性痛覺異常和熱痛覺過敏有一定的緩解作用［21－22］。本實驗我們采用大黃素進行干預治療后發(fā)現(xiàn)，大黃素能明顯提高TN大鼠的機械痛敏閾值，而且從術(shù)后d 5開始明顯增加，于術(shù)后d 11開始和對照組差異無顯著性。這些結(jié)果表明大黃素對TN大鼠的機械痛敏具有一定的抑制作用，可以緩解TN大鼠神經(jīng)病理痛的行為學表現(xiàn)。用大黃素對TN大鼠進行治療后，RT-PCR和原位雜交技術(shù)檢測結(jié)果表明TN大鼠手術(shù)側(cè)TG中升高的P2X2/3受體mRNA表達有明顯下降，免疫組化和蛋白印跡技術(shù)檢測結(jié)果也表明大鼠手術(shù)側(cè)TG中P2X2/3受體蛋白的表達也有明顯下降。因此提示大黃素可能是通過抑制P2X2/3受體表達上調(diào)而對三叉神經(jīng)痛大鼠的機械痛敏發(fā)揮抑制作用，大黃素對P2X2/3受體介導的三叉神經(jīng)痛具有一定抑制作用。

總之，TN是一個非常復雜的病理過程，對原發(fā)性三叉神經(jīng)痛迄今為止還沒有一個確切的病因解釋，也沒有特別有效且副作用比較小的藥物治療，有必要進一步研究該病的分子機制，以便尋找新的治療方法。本研究表明P2X2/3受體涉及到TN大鼠的疼痛傳遞過程，大黃素可以降低TN大鼠 TG中P2X2/3受體的表達，抑制TN大鼠的機械痛敏，提示大黃素有可能成為TN治療的新的靶點藥物，促進TN的治療發(fā)展。

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