王國峰，尹魯平，趙 霞，陳冬梅

(1.濟南軍區(qū)總醫(yī)院干部病房三科，山東 濟南 250031;2.中國科學院生物物理所腦與認知科學中心，北京 100101)

腦卒中(stroke)是以局灶性神經(jīng)功能缺失為共同特征，或伴發(fā)意識障礙的急性腦血管疾病。缺血性腦卒中(ischemic stroke)是最常見腦卒中類型，有關腦缺血病理機制的學說眾多，如興奮性氨基酸釋放增多、細胞內鈣超載、代謝性酸中毒等，但據(jù)此采取的治療措施均不能獲得理想療效，尚缺乏有效的治療藥物。

芍藥苷(paeoniflorn，PAE)是傳統(tǒng)中藥處方芍藥根的主要成分，具有抗氧化、增強認知功能及內皮依賴性舒張血管等藥理活性［1－3］。既往研究表明，PAE可通過激活腺苷Al受體，并抑制與之偶聯(lián)的MAPK通路，阻斷花生四烯酸通路炎癥蛋白COX-2和5-LOX在腦缺血中過度表達，模擬缺血預適應(ischemic preconditioning，IPC)誘導藥理預適應發(fā)揮延遲神經(jīng)保護作用［4］。

本文在上述基礎上進一步研究PAE對腦缺血的治療作用及其對M受體信號通路的調節(jié)機制，旨在為腦卒中的治療提供新靶點、新策略。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康♂大鼠(Sprague-Dawley，鼠齡60～90 d，體質量220～250 g)由中國科學院上海實驗動物中心提供［SPF級，合格證書號:SCXK(滬)2002-0010］。

1.2 藥品與試劑 PAE(純度98.5%):購于中國藥品與生物制品檢定所。2，3，7-三苯基氯化四氮唑(TTC)購自 Sigma(Aldrich，St Louis，USA);TRI-REAGENT-LS試劑盒購自 Molecular Research Center，Inc.(Cincinnati，USA);RNasin、dNTP、Oligo(dT)18引物和 DNA polymerase購自 Sangon Biotechnology Co.(Shanghai，China);M-MuLV 逆轉錄酶購自 Fermentas，Inc.(Vilnius，Lithuania);DNA 熒光染 料SYBR Green I購自 Roche Co.(Mannheim，Germany);其它均為國產分析純試劑。

1.3 實驗分組 ① 模型組:MCAO(90 min)，再灌注(24 h)，缺血同時給予生理鹽水(2 ml·kg－1，ip，14 days，每天兩次)，即從缺血計算為0時，大腦中動脈梗死90 min后拔出絲線再灌24 h;于缺血0時給予生理鹽水，連續(xù)14 d;② PAE治療組:MCAO(90 min)，再灌注(24 h)，缺血同時給予PAE(2.5、5、10 mg·kg－1，ip，14 d，每天兩次);③ 假手術組。n=8。大鼠生理指征如血氧、血糖等于MCAO前、MCAO過程中及再灌后30 min分別測定，實驗過程中動物體溫始終維持(37±1)℃。

1.4 大腦中動脈梗死模型的建立 參考Takano模型［5］，采用可逆性大鼠大腦中動脈栓塞法造成局灶性腦缺血模型。以水合氯醛(300 mg·kg－1，ip)麻?醉大鼠，頸部切口，游離頸外動脈，遠端結扎。取頭端呈圓球狀4#尼龍線，由頸外動脈根部經(jīng)頸內動脈向前延伸，插入約20 mm，遇到阻力停止。栓塞90 min后拔出栓線，再灌注24 h。

1.5 神經(jīng)體征評分標準 根據(jù) Sydserff等［6］神經(jīng)體征評分:無明顯體征(0分);將大鼠懸空觀察，其損傷對側前肢屈曲(1分);損傷對側據(jù)抗推力下降(2分);提尾向損傷的對側轉圈但自由行走時不轉圈(3分);自發(fā)性向損傷對側轉圈(4分)。

1.6 TTC染色后腦梗死體積的測定 將大鼠斷頭后，立即取出大腦，置－20℃約15 min，大腦作連續(xù)冠狀切片(片厚2 mm)。腦片置于1%TTC(pH 7.2)37℃孵育10 min染色，10%甲醛溶液固定。數(shù)碼相機拍照，測定腦梗死體積。

1.7 逆轉錄－多聚酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) 采用RT-PCR技術對mRNA表達進行定量。再灌注24 h后分離皮層、海馬和紋狀體。TRIzol提取總RNA，逆轉錄反應液中如下:3 μl(1 μg)總RNA提取液，2 μl 10 mmol·L－1dNTPs，1 μl(1.6 μg)Oligo(dT)18作為引物，1 μl(20 U)RNase抑制劑(Promega，USA)，1 μl(20 U)M-MuLA 反轉錄酶及 4 μl 5 ×buffer。反應條件為:變性(94℃，30 s)，退火(68℃，30 s)，延伸(72℃，45 s)，共35個循環(huán)。以2%瓊脂糖電泳分離，溴乙啶染色后用凝膠分析儀觀察，以看家基因β-actin作為內參，計算相對光密度值。

2 結果

2.1 PAE對腦梗死體積及神經(jīng)功能缺陷的影響

PAE對腦缺血/再灌注損傷(I/R)的治療學作用如Fig 1 所示，PAE 在2.5、5 和10 mg·kg－1劑量14 d 治療后，腦梗死體積分別降低為模型組的0.64倍、0.5倍及0.48倍(P＜0.01);神經(jīng)功能評分分別降低為模型組的0.35倍、0.3倍和0.3倍(P＜0.01)。提示PAE對腦缺血/再灌注損傷具有良好治療學作用。

2.2 對M受體基因表達的影響 PAE對不同腦區(qū)I/R后M受體基因表達的影響如Fig 2所示。在皮層、海馬和紋狀體，PAE治療性給藥14 d后與模型組相比，使M1受體基因表達分別增加1.78倍、1.87倍和1.58倍(P＜0.01);使M3受體基因表達分別增加3.5倍、3.2倍和3.07倍(P＜0.01);使M5受體基因表達分別增加3.9倍、1.6倍和1.38倍(P＜0.01)。

Fig 1 Effects of PAE on the size of cerebral infarct measured by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)staining after transient MCAO followed by reperfusion(±s，n=8)

進一步研究了PAE對突觸前M2和M4基因表達的影響。在皮層和海馬，PAE治療性給藥14 d后與模型組相比，使M2受體基因表達分別降低3.38倍和1.28倍(P＜0.01);在皮層、海馬和紋狀體，使M4受體基因表達分別增加2.05倍、1.55倍和1.23倍(P＜0.01)。

2.3 對G蛋白基因表達的影響 進一步研究了I/R及PAE治療對與不同亞型M受體相偶聯(lián)的G蛋白基因表達影響(Fig 3)。在3個腦區(qū)，I/R可誘導與M2和M4相偶聯(lián)的Gi蛋白基因表達增高，PAE治療給藥14 d后抑制該病理性改變(P＜0.01);I/R和PAE對與M1、M3和M5相偶聯(lián)的Gαq/11基因表達的影響與此相反。

Fig 2 Effects of PAE on M1～M5(A～E)muscarinic receptors gene expression after transient MCAO in cortex，hippocampus and striatum of rats(±s，n=4)

2.4 對ATP敏感性鉀通道基因表達的影響 I/R可誘導Kir6.1基因表達上調及Kir6.2表達下調，導致Kir6.2/Kir6.1比值在腦缺血時下調，PAE逆轉該病理改變(P ＜0.01，F(xiàn)ig 4)。

Fig 3Effects of PAE on Giα and Gq/11α gene expression after transient MCAO in cortex，hippocampus and striatum of rats(±s，n=4)

3 討論

3.1 調節(jié)M受體基因表達，促進興奮性突觸傳遞為其抗腦缺血新機制 根據(jù)M受體i3環(huán)結構、信號轉導途徑和生物效應的差異，M受體被分為2類。M1、M3和M5主要通過G蛋白－磷脂酶C-二?；视?三磷酸肌醇(Gq-PLC-DAG/IP3)通路起作用，為M1組;M2和 M4激活 Gi/o-腺苷酸環(huán)化酶(AC)-cAMP信號通路，為M2組。中樞M1大量表達于皮層、海馬和紋狀體，通過影響皮層和海馬之間的交互活動發(fā)揮調節(jié)記憶、學習等高級認知功能;M2主要分布在海馬、腦干、丘腦等區(qū)域膽堿能神經(jīng)元突觸末梢，調控中樞乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)釋放;M4主要表達于紋狀體內，與多巴胺(DA)受體共存，抑制紋狀體內DA釋放、調控ACh介導的運動能力;M5全腦表達量不足2%，主要在海馬及黑質DA能神經(jīng)元表達［7］，腦微血管內皮細胞M5的激活介導大腦中動脈血管舒張反應，增加腦血流供應，M5基因敲除小鼠喪失腦血管舒張功能，對腦缺血損傷易感性增高［8］。

有報道，腦缺血1～3周后，腦血流明顯降低，缺血的皮層M1受體數(shù)目降低，M受體結合力減弱［9］;雙側頸動脈結扎誘導的腦缺血小鼠，皮層M3、M5受體及膽堿乙?；D移酶(ChAT)的mRNA表達降低［10］。但有關M受體及其信號轉導系統(tǒng)與腦缺血的關系尚無系統(tǒng)報道。本文基于已有報道，系統(tǒng)研究了不同M受體亞型及其信號通路在腦缺血中的改變，并進一步探討PAE的神經(jīng)保護機制。

M1、M3和M5受體調節(jié)興奮性突觸傳遞，而M2和M4調節(jié)抑制性突觸傳遞。PAE可上調腦缺血/再灌注損傷誘導的M1組受體-M1、M3和M5基因表達，逆轉腦缺血誘導的與M1組受體偶聯(lián)的Gα/11基因表達的降低，從而促進PLC生成，激活 IP3/Ca2+，升高胞內Ca2+濃度產生神經(jīng)保護作用。與此相反，PAE下調腦缺血誘導的突觸前M2受體基因表達，抑制其負反饋調節(jié)，從而促進ACh的釋放，產生興奮性突觸效應，發(fā)揮神經(jīng)保護作用;有報道M4受體位于海馬的興奮性突觸末梢，海馬腦片缺氧再灌注24 h后，CA1區(qū)M4受體的mRNA表達消失，谷氨酸能突觸傳遞功能降低，與此同時觀測到的M受體介導的興奮性神經(jīng)遞質釋放減弱相一致［11］(海馬腦片再灌注20 h后，氨甲酰膽堿可抑制CA1區(qū)EPSP的生成)，因此，PAE對M4亞型的調節(jié)與M2相反，可明顯抑制腦缺血誘導的M4受體基因表達的降低。

由此可見，PAE對M受體及其信號通路調節(jié)，最終產生共同效應，即促進興奮性突觸傳遞而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

Fig 4 Effects of PAE on ATP-sensitive potassium(KATP)channel:Kir6.1，Kir6.2 gene expression and Kir6.2/Kir6.1 ratio after transient MCAO in cortex，hippocampus and striatum of rats(±s，n=4)

3.2 增加Kir6.2/Kir6.1比值為其發(fā)揮神經(jīng)保護作用新途徑 ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)由內向整流 K+通道家族(Kir6.1和 Kir6.2)及硫脲受體異構體(SUR1、SUR2A和SUR2B)組成，其開放是缺血預適應重要神經(jīng)保護機制。大量研究表明KATP開放劑可明顯減輕腦缺血后神經(jīng)功能缺損，減少腦梗死體積，并通過抑制線粒體和死亡受體信號通路減少神經(jīng)元凋亡，對腦缺血/再灌注損傷發(fā)揮保護作用［12］。海馬CAl區(qū)對缺氧極為敏感，缺氧激活K+內流使細胞膜超極化，阻止Na+、Ca2+超載，細胞膜去極化和胞膜降解，而KATP有助于K+內流的激活。Kir6.2基因敲除小鼠在發(fā)生腦缺血15 min后即出現(xiàn)嚴重神經(jīng)功能缺失癥狀，梗死體積明顯大于Kir6.2(+/+)野生型小鼠，體外細胞試驗也證實了這一點［13］;心肌缺血60 min/再灌注24 h的犬，心肌線粒體中Kir6.1蛋白表達水平上調［14］;離體培養(yǎng)的胎鼠前腦皮層神經(jīng)元，以 Aβ1-42處理24 h后，免疫組化和Western blot研究均證明Kir6.1表達明顯增加，而KATP開放劑二氮嗪則抑制其蛋白表達［15］。本研究也證實腦缺血可誘導Kir6.2基因表達下調及Kir6.1基因表達的上調，故Kir6.2/Kir6.1比值降低;PAE逆轉上述病理改變，增加Kir6.2/Kir6.1比值，激活KATP通道發(fā)揮神經(jīng)保護功能。

綜上所述，芍藥苷通過調節(jié)M受體—G蛋白—KATP通道發(fā)揮神經(jīng)保護作用，具有發(fā)展為安全、有效、機制新穎的抗腦缺血候選藥物應用前景。

［1］Mao Q Q，Zhong X M，Li Z Y，et al.Paeoniflorin protects against NMDA-induced neurotoxicity in PC12 cells via Ca2+antagonism［J］.Phytother Res，2011，25(5):681－5.

［2］Mao Q Q，Zhong X M，F(xiàn)eng C R，et al.Protective effects of paeoniflorin against glutamate-induced neurotoxicity in PC12 cells via antioxidant mechanisms and Ca(2+)antagonism［J］.Cell Mol Neurobiol，2010，30(7):1059－66.

［3］Tang N Y，Liu C H，Hsieh C T，et al.The anti-inflammatory effect of paeoniflorin on cerebral infarction induced by ischemia-reperfusion injury in Sprague-Dawley rats［J］.Am J Chin Med，2010，38(1):51－64.

［4］Chen D M，Xiao L，Zhu X Z，et al.Involvement of multitargets in paeoniflorin-induced preconditioning［J］.J Pharmacol Exp Ther，2006，319(1):165－80.

［5］Takano K，Tatlisumak T，Bergmann A G，et al.Reproducibility and reliability of middle cerebral artery occlusion using a silicone-coated suture(Koizumi)in rats［J］.J Neurol Sci，1997，153:8－ 11.

［6］Sydserff S G，Borelli A R，Green A R，et al.Effect of NXY-059 on infarct volume after transient or permanent middle cerebral artery occlusion in the rat:studies on dose，plasma concentration and therapeutic time window［J］.Br J Pharmacol，2002，135:103－12.

［7］Bendor J，Lizardi-Ortiz J E，Westphalen R I，et al.AGAP1/AP-3-dependent endocytic recycling of M5 muscarinic receptors promotes dopamine release［J］.EMBO J，2010，29(16):2813－26.

［8］Gericke A，Sniatecki J J，Mayer V G，et al.Role of M1，M3and M5muscarinic acetylcholine receptors in cholinergic dilation of small arteries studied with gene-targeted mice［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，300(5):H1602－ 8.

［9］Hoff E I，Steinbusch H W，van Oostenbrugge R J，et al.Alterations in the cholinergic system after frontal cortical infarction in rat brain:Pharmacological magnetic resonance imaging of muscarinic receptor responsiveness and stereological analysis of cholinergic forebrain neurons［J］.Neurobiol Dis，2011，43(3):625－ 34.

［10］Zhao Q，Murakami Y，Tohda M，et al.Chotosan，a kampo formula，ameliorates chronic cerebral hypoperfusion-induced deficits in object recognition behaviors and central cholinergic systems in mice［J］.J Pharmacol Sci，2007，103(4):360－73.

［11］Zhang G，Zhang L，Logan R，et al.Decreased expression and impaired function of muscarinic acetylcholine receptors in the rat hippocampus following transient forebrain ischemia［J］.Neurobiol Dis，2005，20(3):805－13.

［12］Ye Z，Guo Q，Wang N，et al.Delayed neuroprotection induced by sevoflurane via opening mitochondrial ATP-sensitive potassium channels and p38 MAPK phosphorylation［J］.Neurol Sci，2011，Jul 1［Epub ahead of print］.

［13］Sun H S，F(xiàn)eng Z P，Barber P A，et al.Kir6.2-containing ATP-sensitive potassium channels protect cortical neurons from ischemic/anoxic injuryin vitroandin vivo［J］.Neuroscience，2007，144(4):1509－15.

［14］Mykytenko J，Reeves J G，Kin H，et al.Persistent beneficial effect of postconditioning against infarct size:role of mitochondrial K(ATP)channels during reperfusion［J］.Basic Res Cardiol，2008，103(5):472－84.

［15］Ma G，Gao J，F(xiàn)u Q，et al.Diazoxide reverses the enhanced expression of KATP subunits in cholinergic neurons caused by exposure to Aβ1-42［J］.Neurochem Res，2009，34(12):2133－40.