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        大鼠非酒精性脂肪肝模型的建立

        2012-12-03 10:55:22張青峰劉詠煌
        四川畜牧獸醫(yī) 2012年12期
        關(guān)鍵詞:高脂酒精性脂肪肝

        張青峰,劉詠煌

        (1.貴州省遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū),廣東 珠海 519041;2.貴州省遵義醫(yī)學(xué)院珠海第五附屬(珠海)醫(yī)院,廣東 珠海 519100)

        非酒精性脂肪肝(NAFLD),是一種無(wú)過(guò)量飲酒史,以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。主要包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬化。NAFLD現(xiàn)已成為常見(jiàn)肝病之一,疾病隨病程的進(jìn)展表現(xiàn)不一。日益增多的資料表明,NAFLD患病率正在逐年增加,已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病,是全球普遍關(guān)注的醫(yī)學(xué)問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。對(duì)于NAFLD目前沒(méi)有特效治療法。非酒精性脂肪肝其肝細(xì)胞線粒體的β氧化增加,當(dāng)消耗完體內(nèi)的抗過(guò)氧化物物質(zhì)時(shí),就容易產(chǎn)生活性氧,氧化應(yīng)激引起的改變可能在NAFLD中起重要作用。樹(shù)莓總黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化活性,能夠降低脂肪肝氧化應(yīng)激水平。本試驗(yàn)旨在用喂養(yǎng)高脂飼料的方法來(lái)建立穩(wěn)定的非酒精性脂肪肝模型,為進(jìn)一步研究樹(shù)莓總黃酮對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝的防治效果做前期準(zhǔn)備。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠40只(雄性),體重在160~200 g/只,購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件為室溫22℃±1℃,濕度為55%±10%。

        1.2 飼料 普通基礎(chǔ)飼料購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,高脂飼料由82.5%基礎(chǔ)飼料+2%膽固醇+10%豬油+0.5%膽酸鈉+5%蛋黃粉組成。

        1.3 方法

        1.3.1 動(dòng)物分組 用普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)SD大鼠,一周后,將40只SD大鼠隨機(jī)分為兩組,其中正常對(duì)照組有10只,模型組有30只。

        1.3.2 高脂飼料的制備 首先按照高脂飼料的配方比例稱取相應(yīng)的量:普通飼料(82.5g/kg)、膽固醇(20g/kg)、豬油(100g/kg)、膽酸鈉(5g/kg)、蛋黃粉(50g/kg)。將普通基礎(chǔ)飼料粉碎,與膽固醇、膽酸鈉、蛋黃粉混勻,再加入液態(tài)的豬油混勻,最后加入適量的水,做成條狀,用烤箱在80℃溫度下烘烤至干,備用。

        1.3.3 模型建立 正常對(duì)照組飼喂普通基礎(chǔ)飼料,模型組飼喂高脂飼料,每組喂養(yǎng)100g/d,自由飲水,每周稱重一次并記錄。

        1.3.4 標(biāo)本采集 大鼠飼喂12周后,取材之前空腹12h,用5%水合氯醛溶液(0.7mL/100g)將大鼠腹腔注射麻醉,固定后迅速解剖,采集心臟血5mL于抗凝管分裝并標(biāo)記,將所取的血離心(2 500 r/min,15 min)獲取血清并立即送往遵義醫(yī)學(xué)院珠海附屬醫(yī)院進(jìn)行血清指標(biāo)檢測(cè)。取出肝臟,用生理鹽水沖洗干凈后置于10%甲醛中保存待檢。

        1.3.5 肝臟病理學(xué)觀察 采血后將大鼠肝臟取出,觀察肝臟的大小、形狀、顏色,并詳細(xì)記錄觀察結(jié)果。然后從肝小葉上切取一塊肝組織(大約1 cm×1 cm×0.2~0.3 cm)置于10%福爾馬林溶液中固定24h左右,制作成石蠟切片,染色后在顯微鏡下觀察結(jié)果。

        1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,試驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示。P<0.05表示差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組大鼠肝臟的一般情況 正常對(duì)照組的肝組織形態(tài)正常,顏色鮮紅,表面光滑,邊緣銳利,質(zhì)地紅潤(rùn)柔軟。模型組的肝臟體積明顯增大,重量也比正常對(duì)照組重,顏色呈棕黃色,肝葉粘連,肝臟切面油膩。

        2.2 肝臟指數(shù) 正常對(duì)照組和模型組的體重、肝濕重、肝指數(shù)(肝重/體重)結(jié)果見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組相比,模型組體重?zé)o明顯變化(P>0.05),肝濕重和肝指數(shù)顯著增高(P<0.01)。

        表1 SD大鼠的體重、肝濕重、肝指數(shù)比較

        2.3 血清指標(biāo) 模型組血清指標(biāo)TC、TG、ALT、AST、HDL-C、LDL-C含量變化與正常對(duì)照組的對(duì)比情況見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn),模型組與對(duì)照組相比血清TC、TG、ALT、AST、LDL-C水平顯著升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組HDL-C水平低于正常對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        表2 大鼠各血清指標(biāo)比較

        圖1 模型組肝組織鏡檢觀察結(jié)果

        2.4 肝臟病理學(xué)改變 由病理照片(圖1和圖2)可見(jiàn),正常對(duì)照組的肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰,肝細(xì)胞無(wú)脂肪變性,細(xì)胞核位于細(xì)胞中央;模型組的肝細(xì)胞體積增大,有大量的空泡狀細(xì)胞,肝細(xì)胞脂肪變性明顯,細(xì)胞核被擠向一邊,部分細(xì)胞出現(xiàn)氣球樣變。按照病理學(xué)對(duì)脂肪肝的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將脂肪肝分為輕度、中度和重度:低倍鏡下,肝細(xì)胞脂肪變性占肝小葉1/3~1/2者為輕度脂肪肝;占肝小葉1/2~2/3者為中度脂肪肝;占肝小葉2/3以上或者肝細(xì)胞彌漫脂肪性變性呈漁網(wǎng)狀者為重度脂肪肝。模型組大鼠的脂肪變性都在中度脂肪肝以上。

        圖2 正常對(duì)照組肝組織鏡檢觀察結(jié)果

        3 討論

        非酒精性脂肪肝是指除酒精以外的各種原因引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積過(guò)多的病變,主要病因是由于過(guò)多攝入熱量,身體肥胖所致,用高脂飼料造模就是利用了這個(gè)原理。從試驗(yàn)結(jié)果看,模型組大鼠的肝臟指數(shù)——肝濕重、肝指數(shù)都明顯高于正常對(duì)照組。從病理學(xué)角度觀察看,模型組大鼠的肝臟呈棕黃色,切面油膩,肝細(xì)胞體積明顯增大,細(xì)胞核被擠到一邊,有大量空泡狀細(xì)胞,具備人類脂肪肝特征。這些都說(shuō)明改良的高脂飲食造模成功。

        本試驗(yàn)通過(guò)飼喂大鼠高脂飼料成功地建立了動(dòng)物非酒精性脂肪肝模型,在造模12周后,模型組的血清指標(biāo) TC、TG、ALT、AST、LDL-C 明顯高于正常對(duì)照組,HDL-C明顯低于正常對(duì)照組,說(shuō)明檢測(cè)血清TC、TG、ALT、AST、LDL-C、HDL-C 等指標(biāo)在一定程度上可以反映非酒精性脂肪肝的病變程度。

        飼喂大鼠高脂飼料成功地建立了非酒精性脂肪肝模型,說(shuō)明本試驗(yàn)所用的高脂飼料配方對(duì)于建立非酒精性脂肪肝模型是可行的,但也有一定的問(wèn)題。因飼料中摻入了膽固醇、豬油等油膩物質(zhì),使飼料性質(zhì)發(fā)生改變,且有異味,動(dòng)物易出現(xiàn)“厭食”或腹瀉;另外,造模所需的時(shí)間長(zhǎng)、病變輕。然而由于該模型制作方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、價(jià)格低廉、動(dòng)物死亡率低、復(fù)制率高,病變有漸進(jìn)性發(fā)展過(guò)程,造模停止后病變逆轉(zhuǎn)緩慢便于藥物干預(yù)研究,因此仍然是國(guó)內(nèi)外最常用的脂肪肝模型。

        4 結(jié)論

        通過(guò)改良的高脂飼料飼喂SD大鼠12周后,進(jìn)行病理學(xué)觀察和血清指標(biāo)檢測(cè),證明SD大鼠非酒精性脂肪肝模型建立成功,可以為后續(xù)研究奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

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