金俊成，常文貴，高 云

（1.皖西學(xué)院 材料與化工學(xué)院，安徽 六安237012；2.安徽仿生傳感與檢測技術(shù)省級實(shí)驗室，安徽 六安237012）

1 引言

光散射是指一束光線通過介質(zhì)時在入射光以外的方向上觀察到的光現(xiàn)象，它是電磁輻射與物質(zhì)相互作用的一種表現(xiàn)形式。光散射技術(shù)在物理化學(xué)、膠體化學(xué)、高分子化學(xué)研究中具有十分重要的地位。1993年R F Pasternack等［1］用特殊的共振光散射技術(shù)研究了卟啉類化合物在核酸上的聚集，首次將該技術(shù)與化學(xué)過程聯(lián)系起來。目前這種技術(shù)被廣泛應(yīng)用于核酸［2］、蛋白質(zhì)［3］、肝素［4］等生物大分子的研究和測定，應(yīng)用于痕量金屬［5］、非金屬［6］、無機(jī)小分子［7］和某些有機(jī)物如表面活性劑［8］的測定，此外，對某些藥物測定［9］、在納米技術(shù)［10］方面也有一定的應(yīng)用。

蛋白質(zhì)、核酸和糖類是構(gòu)成生物體的基本物質(zhì)，擔(dān)負(fù)著生命活動過程中多種極其重要的功能。因此，蛋白質(zhì)定量測定是生物化學(xué)、臨床檢驗中疾病診斷和檢查治療效果、藥物分離提純及食品檢驗中常見的分析項目。測定蛋白質(zhì)含量的方法有很多，目前應(yīng)用最廣的有吸光光度法、熒光光度法等。近年來，共振瑞利散射法因其靈敏度高，選擇性好，用于測定蛋白質(zhì)已引起人們廣泛關(guān)注［11］。

本文研究了酸性偶氮染料莧菜紅 （Amaranth）與蛋白質(zhì)體系的共振散射光譜。在pH為3.80的介質(zhì)中加入蛋白質(zhì)后，莧菜紅-蛋白質(zhì)體系的共振光散射顯著增強(qiáng)。優(yōu)化了該反應(yīng)體系用于測定蛋白質(zhì)的反應(yīng)條件，并用于測定雞蛋清試樣中總蛋白質(zhì)含量。

2 實(shí)驗部分

2.1 儀器與試劑

RF-5301PC型熒光分光光度計（日本島津公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

卵清白蛋白（OVA）（天津華美生物工程公司產(chǎn)品）；莧菜紅（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所 ）；鄰苯二甲酸氫鉀；鹽酸。所用試劑均為分析純，實(shí)驗用水均為二次蒸餾水。

2.2 實(shí)驗原理

瑞利散射（RS）是散射光波長等于入射光波長，而且散射離子（如分子）又遠(yuǎn)小于入射光波長產(chǎn)生的彈性散射，其散射強(qiáng)度與波長的4次方成反比。若散射峰在吸收峰附近或位于吸收帶中，則能產(chǎn)生更強(qiáng)的瑞利散射，使散射強(qiáng)度急劇增強(qiáng)。這主要是由于散射與吸收的共振作用，產(chǎn)生了一個吸收-再散射的過程，從而使散射光強(qiáng)度提高幾個數(shù)量級，此時偏離散射光強(qiáng)度與入射光波長的4次方成反比關(guān)系，這種吸收-再散射的過程稱為共振瑞利散射（RRS）。

大多數(shù)有機(jī)染料能以靜電結(jié)合于蛋白質(zhì)表面，形成聚合體，聚合體體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于有機(jī)染料自身的聚集體積，光散射信號與聚合體體積的2次方成正比，與聚合體濃度成正比。因此，染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后，光散射強(qiáng)度大大增加且與加入蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系。在酸性條件下，由于帶負(fù)電荷的莧菜紅與帶正電荷的蛋白質(zhì)通過以靜電引力為主的分子間作用力結(jié)合為復(fù)合物，使體系的共振光散射明顯增強(qiáng)，并在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系。

2.3 實(shí)驗方法

于10mL比色管中依次加入0.60mL 1.0×10-4mol／L的莧菜紅溶液，1.0mL pH 值為3.80的 Clark-Lubs緩沖溶液以及一定量的蛋白質(zhì)溶液，以二次蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。15min后，在熒光分光光度計λex＝λem＝523nm時測定體系的共振散射光強(qiáng)度。

3 結(jié)果與討論

3.1 莧菜紅-蛋白質(zhì)體系的共振光散射光譜

圖1為Δλ＝0nm條件下同步掃描激發(fā)與發(fā)射波長所得的莧菜紅-OVA體系的共振光散射光譜。從圖中曲線可以看出單獨(dú)的莧菜紅（曲線1）與OVA溶液（曲線2）的共振光散射強(qiáng)度比較弱，當(dāng)它們混合后體系的共振光散射顯著增強(qiáng)（曲線3），約在523nm處ΔI有最大值。表明帶負(fù)電荷的莧菜紅與帶正電荷的OVA通過以靜電引力為主的分子間作用力結(jié)合為締合物，使體系的共振光散射增強(qiáng)。

圖1 莧菜紅-OVA體系的共振瑞利散射光譜

3.2 反應(yīng)條件的選擇

3.2.1 反應(yīng)時間與穩(wěn)定性

圖2為OVA-莧菜紅體系在不同時間里的共振瑞利散射強(qiáng)度。由圖2可見，莧菜紅與OVA的反應(yīng)迅速，室溫條件下10min即可反應(yīng)完全，并且在3h內(nèi)熒光強(qiáng)度基本穩(wěn)定不變。因此實(shí)驗選擇反應(yīng)時間為15min。

3.2.2 反應(yīng)酸度的選擇

圖2 OVA-莧菜紅體系熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時間的變化曲線

在50mL 0.2mol／L的鄰苯二甲酸氫鉀溶液中加入0.2mol／L的 HCl溶液，配成一系列不同pH值的緩沖液。實(shí)驗結(jié)果如圖3所示，當(dāng)溶液酸度在2.90～4.00之間變化時，莧菜紅的光散射強(qiáng)度基本不變（曲線1），而OVA-莧菜紅復(fù)合物的共振光散射強(qiáng)度ΔI則在pH＝3.80時達(dá)到最大值（曲線2），隨后ΔI隨著pH值的增大而降低。實(shí)驗選擇pH＝3.80的Clark-Lubs緩沖溶液控制反應(yīng)酸度。

圖3 酸度對OVA-莧菜紅體系熒光強(qiáng)度的影響

3.2.3 莧菜紅濃度的影響

在pH值為3.80的Clark-Lubs緩沖液中，分別取0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8 mL、0.9mL、1.0mL、1.1mL、1.2mL、1.3mL1.0×10-4mol／L的莧菜紅溶液配成一系列不同濃度下的體系，分別測定體系的熒光強(qiáng)度，如圖4所示。由圖4可見，莧菜紅濃度較小時，復(fù)合物的ΔI值較小，這是由于OVA不能與莧菜紅充分結(jié)合。當(dāng)其濃度達(dá)到7.0×10-6mol／L時，ΔI值最大。繼續(xù)增大莧菜紅濃度，則ΔI值又減小，這是因為莧菜紅本身的光吸收使光散射強(qiáng)度減弱。實(shí)驗結(jié)果選擇莧菜紅濃度為7.0×10-6mol／L。

3.2.4 電解質(zhì)氯化鈉的影響

在相同的實(shí)驗條件下，試驗不同濃度的電解質(zhì)NaCl對體系共振光散射強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，當(dāng)電解質(zhì)NaCl的濃度小于4.5×10-3mol／L時對體系的共振散射強(qiáng)度基本上不產(chǎn)生影響。繼續(xù)增大NaCl的濃度，則導(dǎo)致共振散射強(qiáng)度下降。

3.2.5 共存物質(zhì)的影響

圖5 電解質(zhì)NaCl對OVA-莧菜紅體系熒光強(qiáng)度的影響

在0.5mg／LOVA存在下，試驗了氨基酸及一些常見金屬離子對反應(yīng)的干擾作用。試驗結(jié)果列于表1中（表中I1、I2分別表示OVA溶液和加入干擾組分后溶液的熒光強(qiáng)度）。從表1中可以看出，氨基酸 （甘氨酸、色氨酸、精氨酸 ）和常見金屬離子（如鈣、鎘、銅、鐵、鎂、鋅 ）基本上不影響蛋白質(zhì)的測定。

表1 氨基酸及金屬離子對反應(yīng)的干擾作用

3.3 工作曲線的繪制

配制一系列不同濃度的OVA溶液，按2.3實(shí)驗方法，在優(yōu)化的實(shí)驗條件下，分別測定它們的共振光散射強(qiáng)度I，以二次蒸餾水作試劑空白測定其散射光強(qiáng)度I0，散射光增強(qiáng)值ΔI＝I-I0。以濃度C對ΔI作圖，繪制工作曲線如圖6所示。蛋白質(zhì)的濃度在1.5～5.0mg／L范圍內(nèi)與ΔI呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程分別為：ΔIOVA＝11.755 COVA＋106.946，相關(guān)系數(shù)R＝0.9869。

圖6 不同濃度OVA的共振光散射強(qiáng)度，內(nèi)插圖為工作曲線

3.4 檢測限的測定

對空白試樣進(jìn)行11次平行測定，其共振光散射強(qiáng) 度 分 別 為：3.215、3.013、3.108、3.207、3.018、3.129、3.115、3.152、3.037、3.14、3.201。計算得出標(biāo)準(zhǔn)偏差S＝0.0687，OVA的檢測限為209μg／L。

3.5 樣品分析

用上述方法對雞蛋清中總蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定。測定時，首先將新鮮的雞蛋清樣品10g加水100mL稀釋，再從稀釋液中取1.0mL加入到含有0.6mL 1.0×10-4mol／L的莧菜紅溶液和1.0mL pH 值為3.80的Clark-Lubs緩沖溶液的10mL比色管中，以二次蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，15min后測定其共振光散射強(qiáng)度。以測得的相應(yīng)ΔI計算蛋白質(zhì)的濃度，結(jié)果列于表2中。

表2 共振瑞利散射光譜法雞蛋清中總蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

4 結(jié)論

研究了共振瑞利散射法測定蛋白質(zhì)含量的方法，分別試驗了反應(yīng)時間、反應(yīng)酸度、莧菜紅濃度對測定結(jié)果的影響，另外，試驗了電解質(zhì)NaCl、共存物質(zhì)（氨基酸和金屬離子）的影響。在確定的實(shí)驗條件下，對OVA進(jìn)行了測定，并對雞蛋清樣品中總蛋白質(zhì)進(jìn)行了測定。實(shí)驗結(jié)果表明：共振光散射法測定蛋白質(zhì)含量，方法靈敏度高，操作簡便、快速，穩(wěn)定性好，適用于蛋白質(zhì)的微量分析。

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