鄧大旺 陳麗萍 崔健揚(yáng)

（廣東省東莞市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所長(zhǎng)安分所，東莞 523845）

1 前言

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），又稱(chēng)為豬藍(lán)耳病，是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種接觸性傳染病，以母豬發(fā)熱、厭食、流產(chǎn)、胎兒干尸化、產(chǎn)弱仔等繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為主要特征（Done S H et al，1996）[1]。PRRSV根據(jù)抗原性差異分為歐洲型和美洲型，我國(guó)主要流行美洲型。研究顯示，我國(guó)流行的美洲型產(chǎn)生了變異。2006年5月起在我國(guó)南方部分地區(qū)開(kāi)始流行豬的“無(wú)名高熱病”，經(jīng)研究證實(shí)是由PRRSV變異株引起的高致病性豬藍(lán)耳?。℉PPRRS）。

為了診斷和控制PRRS，我國(guó)各地獸醫(yī)工作者相繼建立了一些診斷方法，其中以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的進(jìn)展最為迅速，如我國(guó)簡(jiǎn)中友等（1997）[2]、董永毅等（1998）[3]等建立了間接ELISA，但到目前為止，國(guó)內(nèi)尚未有成熟的供診斷的試劑盒，對(duì)PRRS的檢測(cè)主要依賴(lài)于進(jìn)口試劑盒和一些不宜推廣應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)室方法，如間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)（IPAM）、血清中和試驗(yàn)（SN）等。

為了為建立更準(zhǔn)確、快速、敏感的PRRSV檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)將高致病性藍(lán)耳病病毒（HPPRRSV）增殖后，經(jīng)滅活、乳化制成油佐劑抗原多次免疫試驗(yàn)兔，獲得兔抗PRRSV高免血清，并用間接ELISA檢測(cè)出其效價(jià)。

2 材料與方法

2.1 材料

HPRRSV種毒；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為3只新西蘭大白兔；Mac-145細(xì)胞；一次性0.22 μm過(guò)濾器、細(xì)胞瓶和10 ml吸管及高糖DMEM營(yíng)養(yǎng)粉、新生牛血清、胰酶，青霉素、鏈霉素。ELISA抗體檢測(cè)試劑盒由深圳市綠詩(shī)源生物技術(shù)有限公司提供。

2.2 方法

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將長(zhǎng)滿(mǎn)單層的Marc-145細(xì)胞先倒掉培養(yǎng)液，使用配制的胰酶溶液洗1遍，然后再加入胰酶溶液，在37℃條件下，消化約5～10 min，直至細(xì)胞間出現(xiàn)空隙或細(xì)胞變圓后，倒掉消化液，拍打瓶底，使細(xì)胞脫落。加入生長(zhǎng)液約5～6 ml，反復(fù)吹打幾次，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞，然后分裝與2～3個(gè)細(xì)胞瓶中。再在每個(gè)細(xì)胞瓶中補(bǔ)充生長(zhǎng)液至13 ml，然后置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)1～2 d后即可長(zhǎng)成單層。

2.2.2 病毒增殖

取HPPRRS種毒0.5 ml，接種長(zhǎng)滿(mǎn)單層的Marc-145細(xì)胞，在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中吸附45 min～1 h后，棄去其中的維持液，用DMEM液洗滌細(xì)胞1～2次，再加入13 ml維持液后，在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 d，觀(guān)察2次/d，查看病變發(fā)生情況。如果沒(méi)有病變，則－20℃凍融2～3次，再繼續(xù)傳至第3代，若仍無(wú)病變，則廢棄。待接毒的Marc-145細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE），即細(xì)胞拉網(wǎng)、融合、灶狀脫落，而對(duì)照組細(xì)胞的形態(tài)仍然良好時(shí)收毒。

2.2.3 免疫抗原制備

取上述病毒培養(yǎng)液，加入0.2%甲醛，37℃過(guò)夜滅活。分別和等量的弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑混合，充分乳化后制成免疫用抗原。

2.2.4 免疫接種

3只青年新西蘭大白兔分為2組，A組（2只）為試驗(yàn)組，B組為對(duì)照組（1只）。A組：兔子編號(hào)為01和02，B組對(duì)照組：兔子編號(hào)為03。試驗(yàn)兔免疫情況詳見(jiàn)表1～表3。

表1 首次免疫接種情況表 （8月19日）

表2 第二次免疫接種情況表 （9月3日）

表3 第三次免疫情況表 （9月25日）

最后1次抗原免疫后第10 d，從兔心臟采血，分離血清，經(jīng)離心去掉紅細(xì)胞等組織碎片后，分裝待用。

2.2.5 高免血清ELISA效價(jià)的測(cè)定

PRRSV抗體的檢測(cè)方法及判定標(biāo)準(zhǔn)均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

（1）加入被檢血清（01號(hào)兔血清、02號(hào)兔血清）：取預(yù)包被的微孔板（根據(jù)樣品多少，可拆開(kāi)分次使用），用樣品稀釋液分別將待檢血清作40、80、160、320、640、1 280、2 560、5 120倍稀釋后加入板孔中。每孔加100 μL。并且10倍稀釋陰性、陽(yáng)性對(duì)照血清，陰性、陽(yáng)性對(duì)照各設(shè)2孔，每孔100 μL。另設(shè)一空白對(duì)照孔，空白對(duì)照孔加100 μL稀釋液。輕輕振勻孔中樣品（勿溢出），置37℃溫育30 min。

（2）洗滌：甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗板3次，300μL/孔，每次靜置3 min倒掉，最后一次在不掉屑吸水紙上拍干。

（3）加入酶標(biāo)記抗體：每孔加酶標(biāo)二抗（羊抗兔IgG-HRP結(jié)合物）100μL，置37℃溫育60 min。

（4）洗滌：與步驟（2）相同。

（5）加入底物溶液（TMB溶液）：每孔加底物A液、B液各1滴（50μL），混勻，室溫避光反應(yīng)10 min。

（6）加HF終止液：每孔加終止液1滴（50μL），10 min內(nèi)測(cè)定結(jié)果。

（7）結(jié)果判定：以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔OD630值。

試驗(yàn)成功的條件是陽(yáng)性對(duì)照孔平均OD630值≥0.6，陰性對(duì)照孔平均OD630值≤0.1。樣品OD630值≥0.32，判為陽(yáng)性；樣品OD630值≤0.32，判為陰性。

3 結(jié)果與分析

3.1 接毒后細(xì)胞病變圖片

HPPRRS接種到長(zhǎng)滿(mǎn)單層的Marc-145細(xì)胞，4～6 d后Marc-145細(xì)胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，詳見(jiàn)圖1。

圖1 CPE以及正常細(xì)胞對(duì)照?qǐng)D200x

3.2 間接ELISA法的檢測(cè)結(jié)果

從表4中可以看出，實(shí)驗(yàn)陰陽(yáng)對(duì)照組成立，結(jié)果可靠，高免血清的效價(jià)為1∶1280。

表4 高免血清ELISA效價(jià)測(cè)定結(jié)果

4 討論

自20世紀(jì)80年代PRRS暴發(fā)以來(lái)，免疫接種一直是預(yù)防PRRS的最重要措施。但近年來(lái)由于該病亞臨床性流行病例的出現(xiàn)，對(duì)該病的診斷技術(shù)越來(lái)越受到各國(guó)有關(guān)部門(mén)的重視，并相繼建立了IFA、IPAM、SN、ELISA和RT-PCR等方法。其中ELISA方法因具備穩(wěn)定性好、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為常用的檢測(cè)方法[4-5]。

為了讓ELISA法更適合檢測(cè)PRRSV刺激機(jī)體產(chǎn)生不同抗體的需要，本實(shí)驗(yàn)將高致病性藍(lán)耳病病毒（HPPRRSV）增殖后，經(jīng)滅活、乳化制成油佐劑抗原多次免疫試驗(yàn)兔，獲得兔抗HPPRRSV效價(jià)高達(dá)1∶1280的高免血清，為建立更準(zhǔn)確、快速、敏感的PRRSV檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

[1] 郭寶清，陳章水，劉興文，等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒中分離PRRSV的研究[J].中國(guó)畜禽傳染病，1996，17（2）：1-4

[2] 簡(jiǎn)中友，馬志勇，姜平，等.ELISA檢測(cè)PRRSV抗體方法的建立及血清流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，1997，14（5）：24-26

[3] 董永毅.豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法的研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，1999

[4] Wootton S，Rowland R R，Yoo D.Phosphory1 ationof thenucleocapsidproteinofporcinereproductiveand respiratorysyndromevirus[J].JVirol，2002，76：10569-10576

[5] Sarah K W，Dongwan Y.Homo-oligomerization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein and the role of disulfide linkages[J].JVirol，2003，77（8）：4546-4557