燕 艷 李 牧 季志會* 杜 偉 董 金 張春蘭 陳 健

（1.北京市通州區(qū)科學技術委員會，北京 101101；2.北京市通州區(qū)植物保護站，北京 101117）

金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）是一類廣泛存在于生物體內的低分子量富含半胱氨酸、能被金屬結合的蛋白[1]。MT的生物學意義涉及生物機體微量元素貯存運輸和代謝、重金屬解毒、拮抗電離輻射、清除自由基以及機體生長發(fā)育、生殖衰老、腫瘤發(fā)生、免疫應激反應等各個方面，其研究涉及農業(yè)、醫(yī)藥保健、生物工程、環(huán)境保護等各個領域[2]。因此，開展金屬硫蛋白在不同豬源豬肝中金屬硫蛋白產量規(guī)律研究，對提高金屬硫蛋白產量方面有著重要意義。

本研究以不同品種雜交豬為試驗對象，利用ZnS04·7H2O進行腹腔注射，驗證高劑量鋅對不同豬種作用，研究其對肝臟金屬硫蛋白含量的影響。對高劑量鋅在不同豬源中誘導豬肝金屬硫蛋白含量進行檢測，為提高豬肝金屬硫蛋白含量的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

品種Ⅰ 杜×長×大三元雜交豬購于東方種豬場。

品種Ⅱ 雜種野豬（野豬♂×杜洛克♀）購于通州區(qū)特種經濟動物養(yǎng)殖總場。

品種Ⅲ 國內品種豬種 大白（♂）×榮昌（♀）。

品種Ⅳ 杜洛克（♂）×大白（♀）。

表1 試驗日糧配方及其營養(yǎng)成分

1.2 主要試驗試劑及其配制

主要試驗儀器：組織勻漿器（英國，MSN公司）；高速冷凍離心機（日立公司）；超濾機及膜包（美國PALL公司）；低溫凍干機（德天佑公司）；AKTA系統(tǒng)（美國GE公司）；UV分光光度計（上海尤尼柯公司）

鋅誘導劑：ZnS04·7H2O（分析純）MT（購自American）

巰基試劑的配制：稱取DTNB 297.15 g，鹽酸胍85.95 g，EDTA 55.8 mg用0.1 MPBS溶解并定容至500 ml。

1.3 試驗方法

飼養(yǎng)試驗共4個品種平均重量8 kg左右的豬，在相同飼養(yǎng)管理條件下預試7 d后，分成4組（每組設3個重復，每個重復10頭）。每組用配制好的ZnSO4·7H2O溶液采用腹腔注射法進行誘導，每隔1 d誘導1次。共誘導5次，每次劑量分別為10 mg/kg、20 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg，累計330 mg/kg，誘導結束24 h屠宰取肝臟[3]。

1.3.1 金屬硫蛋白的提取

取新鮮豬肝樣3～5 kg用0.02 mol/LTris-HCl（pH8.6）與豬肝同體積搗碎攪拌勻漿，冷凍離心（8 000 r/min，4℃，30 min），取上清液于另一離心管；再加同體積無水乙醇，攪拌5min，冷凍離心（8 000 r/min，4℃，30 min），離心后取上清液于另一離心管；放入80℃的水浴鍋內水浴5 min，取出后迅速冷卻至室溫，再冷凍離心（8 000 r/min，4℃，30 min），取上清液超濾濃縮至200 ml的溶液。

進行SephedexG50柱層析，用0.01mol/LNH4HCO3進行洗脫，用巰基試劑進行檢測，收集著色洗脫液；在－80℃下冷凍25 h，所得凍干樣即為MT。

1.3.2 金屬硫蛋白的巰基顯色檢測法

將金屬硫蛋白粗提液加入巰基試劑（1∶1），在分光光度計420 nm處讀取吸光度A值。用標準MT純品制作標準曲線，根據A值可在標準曲線上讀出生產的MT濃度[4]。

2 結果與討論

2.1 金屬硫蛋白與吸光度A值的關系

采用純的MT（純度為99.7%）配成1 mg/ml、1.5 mg/ml、2 mg/ml、2.5 mg/ml、3mg/ml的MT標準液，用紫外可見光分光光度計在420 nm下讀取以上各標準液的吸光度A值，MT的濃度與A值的關系為：

Y=0.0713X （Y為A值，X為MT的濃度，R2=0.9916）

鋅誘導不同豬源豬肝中MT的含量，可通過巰基顯色，并用分光光度計讀取各誘導樣的A值，然后再從MT標準曲線上查出（見表2）。

表2 鋅誘導不同豬源豬肝金屬硫蛋白的合成量

2.2 不同品種的豬源對金屬硫蛋白合成量的影響

鋅誘導生成的Zn-MT能被多種金屬置換，在重金屬解毒方面起著重要作用，同時結合在MT中的Zn還能夠行使其它生物學功能，因此鋅被公認為最安全最有效的MT誘導劑[5]。

腹腔注射誘導乳豬會增強乳豬對鋅的耐受性和適應性，本試驗通過硫酸鋅誘導后研究結果表明：由表1可見不同品種平均體重8 kg左右的乳豬，經過屠宰誘導后豬肝平均體重依次為，品種Ⅲ>品種Ⅳ>品種Ⅰ>品種Ⅱ，金屬硫蛋白含量70%以上的提取量大小依次為，品種Ⅲ>品種Ⅳ>品種Ⅰ>品種Ⅱ。經分析表明榮昌與大白雜交的乳豬品種具有體軀較長、腹大而深、肝臟較大等特點，在相同飼養(yǎng)和誘導條件下可以提高金屬硫蛋白產量，每頭體重在8kg左右的乳豬金屬硫蛋白提取量達到了1.08 mg，相對市售杜長大大雜交豬提取金屬硫蛋白含量提高了36%。因此該品種可降低生產成本，適合產業(yè)化生產。

[1] 張桂春.金屬硫蛋白的功能及應用前景[J].煙臺師范學院學報，2005，21（1）：142-145

[2] 邢樹禮，王洪光.金屬硫蛋白的功能及應用前景[J].生物技術通報，2008，（2）：45-48

[3] 張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術[M].北京：高等教育出版社，1987，216-218

[4] 許梓榮，王敏奇.高劑量鋅促進豬生長的機理探討[J].畜牧獸醫(yī)學報，2001，32（1）：11-17

[5] 張博潤，蔡向榮，懷文輝，等.金屬硫蛋白的研究進展及應用前景[J].微生物學通報，1999，26（5）：355-357