孫亞婷 汪蓓蕾 楊麗娜 張 瑞 郭 剛

研究表明圍生期甲低仔鼠行為學(xué)習(xí)記憶改變與海馬神經(jīng)元凋亡增加密切相關(guān)[1]。胚胎期缺碘、甲狀腺激素不足也影響海馬神經(jīng)元分化發(fā)育[2]。突觸素幾乎存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的所有神經(jīng)末梢，在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞等部位也有突觸素存在，突觸素蛋白能夠作為神經(jīng)發(fā)育的指標(biāo)蛋白[3]。因此，甲狀腺素可能與海馬突觸素的表達(dá)有相關(guān)性。本研究通過(guò)對(duì)孕早、晚期甲狀腺功能減低（甲低）孕鼠補(bǔ)充不同劑量的甲狀腺素，以期發(fā)現(xiàn)甲狀腺素對(duì)子代大鼠海馬區(qū)突觸素表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制作與分組 選用斷乳1個(gè)月的雌、雄性SPF/VAF級(jí)Wistar大鼠（購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）各80只，體質(zhì)量90～110 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將雌性大鼠隨機(jī)分為正常組（10只）和甲低組（70只），甲低組大鼠均飼以重度缺碘地區(qū)糧食配制的飼料，成分為玉米∶黃豆∶小麥∶小米=3∶3∶3∶1，另外添加必需氨基酸、維生素和無(wú)機(jī)鹽等，飼料經(jīng)過(guò)食品中堿的灰化-砷鈰催化分光光度法測(cè)定，含碘量為13.66 ng/g。甲低組均飲去離子水；對(duì)照組飲含碘量為200 μg/L的碘酸鉀溶液，總碘攝入量相當(dāng)于大鼠生理碘需要量。飼養(yǎng)3個(gè)月后，于大鼠內(nèi)眥取血，測(cè)定血清甲狀腺素，當(dāng)各低碘組大鼠血清總?cè)饧谞钕僭彼幔═T3）、總甲狀腺素（TT4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）及游離甲狀腺素（FT4）水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，表明甲低模型制造成功。然后將甲低組隨機(jī)分為7組，每組10只：低碘孕鼠妊娠1～17 d（妊早期甲低）補(bǔ)充甲狀腺素高、中、低劑量組，甲低孕鼠妊娠18～20 d（妊晚期甲低）補(bǔ)充甲狀腺素高、中、低劑量組和甲低對(duì)照組。高、中、低劑量組每天每100 g體質(zhì)量分別補(bǔ)充甲狀腺素3.5、2.0和0.5 μg[4]。將8組雌鼠與正常Wistar雄性大鼠（食用正常飼料）按1∶1進(jìn)行交配。次日晨檢測(cè)陰栓，做陰道涂片，發(fā)現(xiàn)精子確定為妊娠0 d。8組孕鼠分別取新生當(dāng)天（0 d）、生后7、14及21 d的子鼠右側(cè)大腦半球。

1.2 突觸素的檢測(cè) 將子鼠右側(cè)大腦半球用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，進(jìn)行海馬區(qū)連續(xù)冠狀切片，片厚4 μm。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用SABC法，按說(shuō)明書步驟嚴(yán)格操作，以微波枸櫞酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為免疫組化陽(yáng)性信號(hào)。每個(gè)組別選取3張切片，每張切片選取5個(gè)完整而不重疊的的高倍鏡視野（×400），用顯微鏡觀察并照相。

1.3 突觸素的定量測(cè)定 使用Image-Proò Plus（IPP）測(cè)定每張照片陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度（COD）作為該例的測(cè)量值。同時(shí)測(cè)定同一張照片上胼胝體的COD以作為背景值，用前者減去后者得到矯正的COD。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.0軟件包處理數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同組的兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 突觸素免疫組化染色結(jié)果 突觸素陽(yáng)性染色呈棕黃色點(diǎn)狀或顆粒狀沉積，位于胞漿內(nèi)，胼胝體、血管和膠質(zhì)細(xì)胞不著色，見(jiàn)圖1；陰性對(duì)照切片未見(jiàn)突觸素免疫產(chǎn)物，見(jiàn)圖2。

Figure 1 Positive Result of EnvisionTM Staining of hippocampus synaptophysin圖1 大鼠海馬突觸素染色陽(yáng)性結(jié)果（SABC染色×400）

Figure 2 Showing the negative control of rat hippocampus圖2 大鼠海馬陰性對(duì)照（SABC染色×400）

2.2 各組突出素表達(dá)量比較 正常組的突觸素表達(dá)水平均高于同時(shí)期甲低對(duì)照組（P<0.01）。在新生當(dāng)天，妊晚期甲低中劑量組與甲低對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），妊早、晚期甲低低劑量組突觸素表達(dá)水平均低于甲低對(duì)照組（P<0.01）；妊早期甲低中、高劑量組，妊晚期甲低高劑量組突觸素表達(dá)水平均高于甲低對(duì)照組（P<0.01）。生后7、14、21及28 d，妊早、晚期甲低低劑量組與甲低對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其他各組的突觸素表達(dá)水平均高于甲低對(duì)照組（P<0.001），見(jiàn)表1。

Table 1 The Expression of brain tissue synaptophysin in offspring rat of groups表1 不同組別各日齡子鼠腦組織突觸素的表達(dá)（n=10，COD值，±s）

Table 1 The Expression of brain tissue synaptophysin in offspring rat of groups表1 不同組別各日齡子鼠腦組織突觸素的表達(dá)（n=10，COD值，±s）

**P<0.01

組別甲低對(duì)照組（1）正常組（2）妊早期甲低低劑量組（3）中劑量組（4）高劑量組（5）妊晚期甲低低劑量組（6）中劑量組（7）高劑量組（8）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（1）∶（6）（1）∶（7）（1）∶（8）0 d 0.784±0.020 1.327±0.017 7 d 3.274±0.028 3.698±0.021 14 d 7.311±0.096 7.978±0.082 21 d 7.825±0.016 8.308±0.008 28 d 7.907±0.025 8.584±0.010 0.685±0.046 0.983±0.062 1.260±0.011 3.307±0.073 3.572±0.020 3.621±0.061 7.406±0.039 7.819±0.036 7.862±0.034 7.848±0.027 8.215±0.019 8.236±0.025 7.937±0.031 8.381±0.023 8.416±0.026 0.683±0.039 0.782±0.022 0.975±0.011 170.746**<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 1.000<0.001 3.292±0.080 3.438±0.011 3.569±0.020 35.204**<0.001 0.927<0.001<0.001 0.997<0.001<0.001 7.401±0.049 7.741±0.077 7.812±0.056 49.231**<0.001 0.324<0.001<0.001 0.375<0.001<0.001 7.831±0.093 8.010±0.068 8.198±0.062 28.258**<0.001 0.998<0.001<0.001 1.000 0.018<0.001 7.906±0.024 8.227±0.035 8.359±0.004 359.360**<0.001 0.549<0.001<0.001 1.000<0.001<0.001

3 討論

嬰幼兒在胚胎時(shí)期因缺碘而致甲狀腺激素合成不足，會(huì)導(dǎo)致呆小癥（克汀病），語(yǔ)言、認(rèn)知、行為、聽(tīng)力、運(yùn)動(dòng)等腦功能發(fā)生不同程度的障礙[5]。早期母體低甲狀腺素引起的胎兒神經(jīng)發(fā)育缺陷比先天性的甲減更常見(jiàn)[6]。甲狀腺功能低下動(dòng)物的神經(jīng)元和神經(jīng)叢發(fā)育不全、神經(jīng)遞質(zhì)不足，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞酶譜均不完備[7]。胚胎期與新生期缺碘、甲狀腺激素不足所致海馬核團(tuán)體積變小，細(xì)胞數(shù)目減少，突觸發(fā)育不良，不僅是缺碘、甲狀腺激素不足影響海馬神經(jīng)元分化發(fā)育的結(jié)果，而且還與缺碘、甲狀腺素不足導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加有關(guān)[2]。

突觸素是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的膜蛋白，分子質(zhì)量為38 ku，在神經(jīng)元胞體合成后主要轉(zhuǎn)運(yùn)至軸突終末，特異性地分布于突觸前囊泡膜上。人類和哺乳動(dòng)物的突觸素基因位于X染色體上，在進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性。正常狀態(tài)下突觸素的量在突觸處保持相對(duì)恒定，有實(shí)驗(yàn)用突觸素作為突觸前終末的特異性標(biāo)記物，用來(lái)檢測(cè)突觸的密度和分布[8-9]。

本研究發(fā)現(xiàn)正常組不同時(shí)期的突觸素表達(dá)水平均高于同時(shí)期甲低對(duì)照組，說(shuō)明孕鼠甲低導(dǎo)致子代大鼠海馬突觸素表達(dá)下降。在不同時(shí)期給予甲低孕鼠中、高劑量的甲狀腺素對(duì)海馬突觸素的表達(dá)量有較大的影響，說(shuō)明甲低孕鼠子代大鼠海馬區(qū)突觸素的表達(dá)受補(bǔ)充甲狀腺素劑量及孕期的影響。在甲低孕鼠的妊早期給予高劑量的甲狀腺素可以使子代各時(shí)期海馬突觸素的表達(dá)水平得到明顯改善。

綜上，筆者認(rèn)為子代海馬突觸素表達(dá)量的缺乏可能與孕鼠甲狀腺功能低下有關(guān)，而在妊早期給予高劑量的甲狀腺素可以使甲狀腺功能低下的孕鼠的子代海馬突觸素的表達(dá)量接近正常，能夠起到較好的治療效果。

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