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        花生肽對(duì)衰老模型大鼠血清和心、腦組織抗氧化效果的影響

        2012-11-28 02:28:26陳貴堂趙立艷楊志萍綦國(guó)紅王歲樓
        中國(guó)糧油學(xué)報(bào) 2012年1期
        關(guān)鍵詞:血清模型

        陳貴堂 趙立艷 李 博 楊志萍 綦國(guó)紅 王歲樓

        花生肽對(duì)衰老模型大鼠血清和心、腦組織抗氧化效果的影響

        陳貴堂1趙立艷2李 博1楊志萍1綦國(guó)紅1王歲樓1

        (中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院食品質(zhì)量與安全教研室1,南京 210009)
        (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院2,南京 210095)

        為研究花生肽的體內(nèi)抗氧化效果,將50只SD大鼠隨機(jī)分為5組(對(duì)照組、模型組、低中高劑量花生肽組),除對(duì)照組外,其余各組大鼠按其體重每天皮下注射D-半乳糖400 mg/kg建立衰老模型,同時(shí)3個(gè)花生肽組每天分別按200、500、800 mg/kg的劑量灌胃,持續(xù)50 d。檢測(cè)大鼠血清和心、腦組織中丙二醛或脂褐質(zhì)(LF)含量以及抗氧化酶活力。結(jié)果表明,花生肽能夠有效抑制半乳糖致衰老大鼠體重的下降,減緩胸腺指數(shù)和腦指數(shù)的下降,提高大鼠血清、腦組織中SOD和GSH-Px活性,并能夠降低大鼠血清MDA含量和腦中的LF含量,表明花生肽具有顯著的抗氧化作用。

        花生肽 D-半乳糖 大鼠 抗氧化

        為了降低自由基的傷害,細(xì)胞內(nèi)有很多抗氧化系統(tǒng),包括酶類抗氧化劑和非酶類抗氧化劑,然而隨著年齡增長(zhǎng)、疲勞以及機(jī)體發(fā)生病變等狀態(tài)下,該抗氧化系統(tǒng)的防御能力會(huì)隨之降低,而導(dǎo)致體內(nèi)氧化還原失衡。為了彌補(bǔ)體內(nèi)抗氧化能力的損失,一方面可強(qiáng)化體內(nèi)抗氧化系統(tǒng),如提高SOD的活性或谷胱甘肽的含量等,另一方面則可補(bǔ)充體內(nèi)的抗氧化物質(zhì),故營(yíng)養(yǎng)學(xué)家一直希望找到具有抗氧化性的天然產(chǎn)物以期能用以維持體內(nèi)氧化還原的平衡。

        近十幾年來(lái),源于食物蛋白的抗氧化多肽研究日益增多,其抗氧化活性的評(píng)價(jià)方法也從體外試驗(yàn)向動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)方向發(fā)展,因?yàn)樗鼈冋嬲纳飳W(xué)效能只有通過(guò)人體試驗(yàn)或動(dòng)物試驗(yàn)才能得以闡明。然而,若在人體上進(jìn)行這一漫長(zhǎng)衰老過(guò)程的研究及對(duì)生物抗氧化劑進(jìn)行療效觀察是不易做到的。因此,人們根據(jù)衰老的機(jī)制建立了許多動(dòng)物衰老模型。其中D-半乳糖所致的亞急性衰老模型,可引起心、肝、腎、腦等重要器官的代謝異常,類似人類自然衰老時(shí)的表現(xiàn)[1],所以在抗氧化物質(zhì)的活性評(píng)價(jià)方面得到了廣泛的應(yīng)用[2-4]。

        陳貴堂等[5-7]采用多種試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)了 Alcalase酶解花生蛋白所得花生肽的生物活性,表明花生肽具有很強(qiáng)的抗氧化能力。為進(jìn)一步研究花生肽在體內(nèi)的生理活性,本試驗(yàn)采用D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠模型,通過(guò)研究花生肽對(duì)衰老模型大鼠血清和心、腦組織抗氧化作用的影響,探討花生肽在體內(nèi)抗氧化活性的作用模式,為花生抗氧化肽乃至花生餅粕的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        SPF級(jí)雄性SD大鼠:中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)SCXK11-00-0010;大鼠普通飼料:北京科澳協(xié)力飼料有限公司;D-半乳糖:分析純,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司;花生肽:自制[8];丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)以及考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒:南京建成生物工程研究所。

        1.2 儀器與設(shè)備

        全塑動(dòng)物代謝籠:自制;101-3E電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;Lambda 7紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、Ls-5熒光光度計(jì):美國(guó)P.E公司;Sartorius電子天平:德國(guó)哥廷根賽多利斯股份有限公司;LDZ5-2自動(dòng)平衡離心機(jī):北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

        1.3 方法

        1.3.1 動(dòng)物分組及處理

        根據(jù)體重將大鼠隨機(jī)分為5組,即對(duì)照組、D-半乳糖致衰老模型組,低、中、高劑量花生肽組。除對(duì)照組外,每天給各組大鼠皮下注射D-半乳糖400 mg/kg BW,給對(duì)照組大鼠皮下注射等量生理鹽水,同時(shí)每天分別按200、500、800 mg/kg BW的劑量給低、中、高劑量花生肽組大鼠灌胃,對(duì)照組及模型組用等量蒸餾水灌胃,每天稱重1次。于空調(diào)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi),在全塑代謝籠內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng),采用對(duì)喂法,保證每只大鼠每天食物攝入量相等。

        在第50天禁食12 h后,大鼠斷頭取血,3 000 r/min離心15 min分離出血清,用于SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量的測(cè)定。解剖大鼠,迅速取出腦、心臟、脾臟及胸腺,剔除其表面的脂肪膜,用生理鹽水沖洗干凈,用濾紙將水分吸去,然后稱重,置潔凈塑料袋內(nèi)密封,低溫保存待測(cè)。

        1.3.2 臟器指數(shù)計(jì)算

        臟器指數(shù)(g/100 g)=臟器質(zhì)量×100/大鼠體重

        1.3.3 血清及心、腦組織中SOD活力測(cè)定

        用黃嘌呤氧化酶法[8]測(cè)定。取血清30μL進(jìn)行測(cè)定;心、腦組織用預(yù)冷的生理鹽水制成10%勻漿,低溫下3 000 r/min離心10 min,取上清液測(cè)定SOD活性。按試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行。以每毫升血清或每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位(U)。

        1.3.4 血清及心、腦組織中GSH-Px活力測(cè)定

        用DTNB顯色法[9]測(cè)定。血清用生理鹽水稀釋5倍,取0.1 mL進(jìn)行測(cè)定;心、腦組織用預(yù)冷的生理鹽水制成 10%勻漿,低溫下 3 000 r/min離心10 min,取上清液進(jìn)行測(cè)定,按試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行。以每毫升血清或每毫克組織蛋白在37℃反應(yīng)5 min,扣除非酶促反應(yīng)作用,使反應(yīng)體系中 GSH濃度降低1μmol/L為一個(gè)活力單位(U)。

        1.3.5 血清及心、腦組織中CAT活力測(cè)定

        用鉬酸銨法[10]測(cè)定。取 0.1 mL 血清或 0.05 mL經(jīng)生理鹽水稀釋的1%心、腦組織勻漿,按試劑盒操作程序加入試劑,測(cè)定其在405 nm處的吸光值,按公式計(jì)算CAT活力,以每毫升血清或每毫克組織蛋白每秒鐘分解1μmoL的H2O2為一個(gè)活力單位(U)。

        1.3.6 血清中MDA含量測(cè)定

        用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[11]。取血清0.2 mL,按試劑盒操作程序加入試劑,反應(yīng)終體積為4.4 mL,反應(yīng)管振蕩混勻后在水浴中煮沸40 min,然后3 500 r/min離心10 min,取上清液在532 nm處測(cè)定其吸光值,根據(jù)公式計(jì)算MDA含量。

        1.3.7 心、腦組織中脂褐質(zhì)含量測(cè)定

        參照衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003)[12]規(guī)定方法略加修改進(jìn)行測(cè)定。取組織200 mg,加入定量蒸餾水用勻漿器制成5%的組織勻漿,然后加入4.0 mL于50℃預(yù)熱的2∶1氯仿/甲醇混合液,用旋渦振蕩器充分混勻,3 000 r/min離心10 min后樣品分為3層,上層為水相,中層為組織,下層為氯仿甲醇相。小心吸去水層,用帶長(zhǎng)麻醉針頭的注射器沿管壁穿過(guò)中層,將下層氯仿甲醇提取液吸出。向提取液中加入甲醇0.2 mL,輕輕振蕩混勻,置紫外燈下照射30 s,倒入石英杯中,以0.1μg/mL的硫酸奎寧為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照,氯仿甲醇混合液為空白對(duì)照,在狹縫 4.4,靈敏度 3.6,激發(fā)波長(zhǎng)360 nm,發(fā)射波長(zhǎng)450 nm下測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度。

        組織中脂褐質(zhì)(Lipofuscin,LF)含量計(jì)算公式:

        LF含量(μg/g組織)=(樣品熒光強(qiáng)度-空白熒光強(qiáng)度/硫酸奎寧熒光強(qiáng)度)×硫酸奎寧濃度×(勻漿體積/樣品質(zhì)量)

        1.3.8 心、腦組織中蛋白質(zhì)含量測(cè)定

        用福林-酚法[13]測(cè)定,以小牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

        1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析

        試驗(yàn)數(shù)據(jù)以(珋x±s)表示,用SPSS11.0軟件包進(jìn)行方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 大鼠的生長(zhǎng)狀況

        在整個(gè)飼養(yǎng)周期,包括致衰老模型組大鼠在內(nèi),所有大鼠食欲良好,體重均呈增長(zhǎng)趨勢(shì),無(wú)感染、腹瀉等異常癥狀,其體重變化如表1所示。各組大鼠初始平均體重基本相同,組間無(wú)顯著差異(P>0.05),給予不同的處理后,各組大鼠生長(zhǎng)速度各不相同,其中對(duì)照組體重增加最快,衰老模型組體重增加最慢,經(jīng)給予花生肽后,大鼠的生長(zhǎng)速度隨著肽劑量的增加而增加。至飼養(yǎng)結(jié)束時(shí),中、高劑量組大鼠體重及食物轉(zhuǎn)化率與對(duì)照組無(wú)明顯差異,而顯著高于衰老模型組(P<0.05)。

        表1 體重增加量及食物轉(zhuǎn)化率

        表2 花生肽對(duì)大鼠臟器重量及臟器指數(shù)的影響

        2.2 花生肽對(duì)大鼠臟器重量及臟器指數(shù)的影響

        由表2可見(jiàn),大鼠心臟、脾臟質(zhì)量及其臟器指數(shù)在各組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比,衰老模型大鼠腦和胸腺質(zhì)量以及腦指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低(P<0.05),而與衰老模型組相比,高劑量花生肽組大鼠腦指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著增高(P<0.05),而中、低劑量花生肽對(duì)大鼠腦指數(shù)和胸腺指數(shù)的增高作用不明顯(P>0.05)。

        2.3 花生肽對(duì)大鼠血清 SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影響

        如表3所示,衰老模型組大鼠血清MDA含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),SOD活性和GSH-Px活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05),CAT活性雖低于對(duì)照組,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。中、高劑量組花生肽組血清SOD活性和GSH-Px活性顯著高于衰老模型組,其GSH-Px活性甚至顯著高于對(duì)照組,MDA含量顯著低于衰老模型組(P<0.05)。低劑量花生肽組血清SOD活性、CAT活性以及MDA含量與衰老模型組無(wú)顯著差異(P>0.05),但其GSH-Px活性卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他4組(P<0.01)。

        表3 大鼠血清SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量

        2.4 花生肽對(duì)大鼠心臟 SOD、GSH-Px、CAT活性和脂褐質(zhì)含量的影響

        如表4所示,各組大鼠心臟SOD、CAT活性以及脂褐質(zhì)含量之間均無(wú)明顯差異(P>0.05),衰老模型組和低劑量花生肽組大鼠GSH-Px活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05),中、高劑量花生肽組GSH-Px活性低于對(duì)照組,而高于衰老模型組和低劑量組,但與它們之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

        表4 大鼠心臟SOD、GSH-Px、CAT活性和脂褐質(zhì)含量

        2.5 花生肽對(duì)大鼠腦 SOD、GSH-Px、CAT活性和脂褐質(zhì)含量的影響

        如表5所示,衰老模型組大鼠腦脂褐質(zhì)含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),SOD活性和GSH-Px活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。中、高劑量花生肽組腦SOD活性略低于對(duì)照組,但顯著高于衰老模型組(P<0.05);高劑量花生肽組腦GSH-Px活性略低于對(duì)照組,但顯著高于衰老模型組(P<0.05);中、低劑量花生肽組GSH-Px活性略高于衰老模型組,但低于對(duì)照組和高劑量花生肽組,其差異均不顯著(P>0.05)。各組大鼠腦CAT活性雖然差別很大,但因?yàn)閭€(gè)體差異較大而無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中、高劑量組大鼠腦LF含量顯著低于衰老模型組(P<0.05),而與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

        表5 大鼠腦SOD、GSH-Px、CAT活性和脂褐質(zhì)含量

        3 討論與結(jié)論

        3.1 D-半乳糖致衰老動(dòng)物模型的建立

        目前D-半乳糖誘導(dǎo)的動(dòng)物模型已成為抗氧化、延緩衰老藥物及保健食品篩選工作中經(jīng)常選用的試驗(yàn)動(dòng)物模型,動(dòng)物試驗(yàn)必測(cè)指標(biāo)為動(dòng)物體重、過(guò)氧化脂質(zhì)含量(MDA或LF)以及抗氧化酶活性(SOD和GSH-Px),如果過(guò)氧化脂質(zhì)含量升高和任一抗氧化酶活性降低,即可判定該受試樣品抗氧化功能動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性[13]。本研究中給成年SD雄性大鼠連續(xù)頸背部皮下注射D-半乳糖7周后,衰老模型組大鼠的血清MDA及腦LF含量明顯高于對(duì)照組,同時(shí)血清SOD、GSH-Px活性及腦SOD、GSH-Px的活性顯著降低,說(shuō)明本試驗(yàn)動(dòng)物模型建造成功。

        3.2 花生肽對(duì)大鼠體重和臟器指數(shù)的影響

        研究表明,試驗(yàn)動(dòng)物給予過(guò)量半乳糖后,生長(zhǎng)遲緩,體重減輕[14-15],本研究也得到了同樣的結(jié)果,但花生肽的補(bǔ)充可有效抵抗大鼠體重的下降。許多學(xué)者認(rèn)為免疫系統(tǒng)功能下降是衰老的主要原因和標(biāo)志。陳海英等[16]在研究健康大鼠衰老指標(biāo)的增齡變化及形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)的相關(guān)性研究中觀察到老年大鼠胸腺的重量和胸腺指數(shù)明顯低于青年大鼠和幼年大鼠;葛斌等[17]和陳貴堂等[6]前期的研究也發(fā)現(xiàn),連續(xù)頸背部皮下注射D-半乳糖4~7周后,小鼠的胸腺和脾臟發(fā)生萎縮,重量明顯減輕,表明半乳糖能致動(dòng)物免疫器官老化及其功能下降,這可能是引起動(dòng)物早衰的原因之一。本研究結(jié)果顯示,D-半乳糖誘發(fā)的衰老模型大鼠脾臟重量和脾臟指數(shù)無(wú)明顯差異,但胸腺重量和胸腺指數(shù)均顯著降低,這說(shuō)明胸腺對(duì)半乳糖的反應(yīng)可能比脾臟更明顯,或者大鼠對(duì)半乳糖的耐受能力比小鼠強(qiáng)。另外,D-半乳糖誘發(fā)的衰老模型大鼠腦重量和腦指數(shù)顯著低于正常組,說(shuō)明D-半乳糖能夠致使大鼠腦萎縮和重量減輕。補(bǔ)充高劑量花生肽(800 mg/kg BW)的大鼠,其胸腺指數(shù)和腦指數(shù)與對(duì)照組相差無(wú)幾,并且顯著高于衰老模型組,表明一定劑量的花生肽能明顯對(duì)抗胸腺和腦的退化,提高免疫功能,抑制大鼠早衰。

        3.3 花生肽對(duì)血清MDA及心、腦LF的影響

        LF沉積是機(jī)體衰老的重要特征之一,而MDA是LF形成過(guò)程的中間產(chǎn)物,它能間接反映機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化水平。大量試驗(yàn)證實(shí),衰老時(shí)MDA水平或LF含量顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖可以誘發(fā)模型動(dòng)物血清的MDA含量顯著升高,腦組織LF沉積明顯增加。而補(bǔ)充高劑量花生肽(800 mg/kg BW)后,可顯著降低血清MDA和腦LF含量,提示花生肽可作為外源性的抗氧化物質(zhì),能夠促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性抗氧化物質(zhì),抑制脂質(zhì)過(guò)氧化損傷,起到延緩衰老的作用。

        3.4 大鼠血清和心、腦組織中抗氧化酶活性的變化

        SOD、GSH-Px和CAT是體內(nèi)重要的三大酶類抗氧化劑,SOD能使超氧自由基歧化為過(guò)氧化氫和氧,CAT可使過(guò)氧化氫分解成為水和氧,GSH-Px可催化還原型的谷胱甘肽轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸偷墓入赘孰?,從而消除?xì)胞中的有機(jī)或無(wú)機(jī)的過(guò)氧化物。本試驗(yàn)結(jié)果表明,D-半乳糖致衰老模型大鼠血清、腦組織中SOD和GSH-Px活性顯著降低。3個(gè)劑量花生肽組能不同程度抑制血清和腦組織中SOD和GSH-Px活力下降,其量效關(guān)系均呈正相關(guān),提示花生肽可通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化作用。

        綜上所述,花生肽能夠有效抑制半乳糖致衰老大鼠體重的下降,減緩胸腺指數(shù)和腦指數(shù)的下降;能夠提高D-半乳糖致衰老大鼠血清、腦組織中SOD和GSH-Px活性,并能夠降低大鼠血清MDA含量和腦中的LF含量,表明花生肽具有顯著的抗氧化作用,但其作用大小與其劑量有直接關(guān)系。

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        Antioxidative Effect of Peanut Polypeptide in Serum,Heart and Brain of D-galactose-induced Aging Rats

        Chen Guitang1Zhao Liyan2Li Bo1Yang Zhiping1Qi Guohong1Wang Suilou1
        (College of Pharmacy,China Pharmaceutical University1,Nanjing 210009)
        (College of Food Science and Tech-nology,Nanjing Agricultural University2,Nanjing 210095)

        To research the antioxidantive effects of peanut polypeptides(PP),fifty SD rats were randomly divided into five groups,namely control,model and three PP- treated groups.Except the control group,all other groups were subcutaneously injected with D -Gal solution(40 mg/mL,0.1 mL/10g mb)daily for successive 50 days.On the same time,rats in the PP treatment groups were orally given PP in the dosage of 200 mg/kg mb,500 mg/kg mb and 800 mg/kg mb,respectively.Then the MDA or lipofuscin(LF)contents,superoxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase(GSH-Px)and catalase(CAT)activities in serum,heart and brain were analyzed respectively.The results showed that D-Gal-induced aging rats model was successfully established.PPsignificantly increased the thymus index and brain index,the levels of SOD,GSH-Px in serum and brain,and obviously decreased the MDA content in serum and LF content in brain in a dosedependent manner.It indicated PPhad an excellent antioxidative action in aging rats induced by D- Gal.

        peanut polypeptide,D- galactose,rat,antioxidative effect

        TQ936.16

        A

        1003-0174(2012)01-0043-05

        2011-04-07

        陳貴堂,男,1977年出生,副教授,博士,食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)

        趙立艷,女,1977年出生,副教授,食品營(yíng)養(yǎng)

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