桂蘭蘭 綜述 謝紅浪 審校

膿毒癥是由細菌、病毒或真菌感染引起的全身性炎癥反應綜合征(SIRS)。全世界每年約有1 800萬膿毒癥患者，常合并低血壓(休克)、單一或多臟器衰竭，死亡率達 25%～70%［1，2］。急性腎損傷(AKI)是膿毒癥最常見的嚴重并發(fā)癥之一，是膿毒癥患者死亡率增加的獨立危險因素［3］。傳統(tǒng)觀點認為，腎血流量(RBF)減少是膿毒癥性AKI的主要機制，主要依賴液體復蘇及血管活性藥物治療，但臨床療效不佳［4］。事實上，RBF在膿毒癥早期可能會減少，但復蘇后因存在高動力循環(huán)，RBF正常甚至增加，在腎臟灌注充足情況下依然存在AKI［5］。因此，AKI發(fā)病機制遠比腎臟低灌注復雜，細胞凋亡、腎小球及管周微循環(huán)障礙、氧化應激、線粒體功能障礙和炎癥反應等多種因素都參與膿毒癥性AKI的發(fā)生。

Toll樣受體(TLRs)存在于固有性免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)細胞表面，提供病原體和生物相互作用界面。TLR4是識別革蘭陰性菌胞壁成分脂多糖(LPS)的主要受體，參與炎癥反應。近期研究證實，阻斷TRL4信號通路可抑制炎癥介質表達，提高膿毒癥患者生存率。本文就TLR4信號通路在膿毒癥性AKI的發(fā)病機制和治療前景作一簡述。

膿毒癥性AKI的炎癥機制

凝血-炎癥網(wǎng)絡在膿毒癥病理生理機制中具有重要意義(圖1)［6］，炎癥反應是AKI直接發(fā)病機制之一。膿毒癥過程可分為炎癥反應和代償性抗炎反應兩個階段。最初表現(xiàn)為明顯炎癥反應，產生大量前炎癥因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1(IL-1)等，進一步作用于巨噬細胞或樹突狀細胞，刺激下游細胞因子IL-6、IL-8生成，引起組織損傷;在初始爆發(fā)性炎癥反應后，逐漸誘發(fā)抗炎反應，如產生抗炎癥因子IL-10、出現(xiàn)抗原提呈無效、T淋巴細胞低反應性、T輔助淋巴細胞1(Th1)增生降低，使患者處于免疫麻痹狀態(tài)進而繼發(fā)感染或對治療干預無效［7］。

TNF-α和IL-1是膿毒癥時誘發(fā)AKI的主要因子，對宿主作用廣泛。動物實驗發(fā)現(xiàn)，注射LPS后豬腎小球內皮細胞和系膜細胞TNF-α表達增加，腎皮質動脈血管內皮細胞IL-1β表達增加［8］。TNF-α受體缺失的小鼠，在注射LPS后腎小管上皮細胞凋亡及腎組織中性粒細胞浸潤明顯減輕，從而避免LPS介導的AKI發(fā)生［9］。Knotek等［10］予野生型鼠腹腔注射可溶性TNF-α受體p55，1h后再注射LPS，預處理組腎小球濾過率下降幅度低于對照組(30%vs 70%)，即中和TNF-α可保護LPS誘導的野生鼠腎功能損傷。TNF-α及IL-1導致AKI發(fā)生的機制包括誘導細胞因子釋放，放大炎癥級聯(lián)反應;表達組織因子促進局部血栓形成;誘導腎小管上皮細胞凋亡;增加活性氧產生導致局部氧化應激等［11，12］。

動物實驗表明，通過調控TLR4信號轉導通路調節(jié)炎癥免疫反應，影響膿毒癥的發(fā)展［13］。因此，對TLR4的研究越來越受到國內外學者的重視，研究阻斷或抑制TLR4信號轉導通路的藥物也是目前研究熱點。

圖1 簡化的膿毒癥病理生理過程［6］

TLR4通路與炎癥因子調控

TLRs是一類模式識別受體家族，通過介導細胞信號轉導系統(tǒng)導致炎癥因子的釋放，從而在識別病原微生物、啟動炎癥應答中起重要作用。TLR4是TLRs家族成員之一，是識別革蘭陰性菌細胞外壁LPS成分的主要受體。在LPS誘導的AKI中發(fā)揮重要作用，通過阻斷TLR4信號通路可帶來膿毒癥AKI治療新手段(圖2)［14］。

圖2 TLR4 信號通路［14］

TLR4結構 TLR4屬于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)三個部分組成。胞外區(qū)由24個亮氨酸重復(LRR)序列組成，整個LRR結構域呈馬蹄形。胞內區(qū)則存在一段序列保守區(qū)，含有大約200個氨基酸殘基，由Toll同源結構域和分子羧基端長短不同的短尾肽(0～22個氨基酸)組成。該序列與IL-1受體胞內區(qū)保守序列具有高度的同源性，稱為Toll樣受體/IL-1同源結構域(TIR)。

TLR4信號轉導胞外部分 TLR4主要識別LPS及具有類脂A結構的衍生物。首先內毒素結合蛋白(LBP)將LPS從細菌外膜上轉移下來，并與其脂質A結合，形成LPS-LBP復合物。然后將復合物中的LPS傳遞給膜結合CD14(mCD14)，再由mCD14將LPS傳遞給TLR4。在髓樣分化蛋白2(MD-2)的協(xié)同作用下，LPS激活TLR4并觸發(fā)信號轉導。

TLR4信號轉導胞內部分

髓樣分化蛋白88(MyD88)依賴性信號轉導途徑 TLR4與配體結合后促使其本身二聚體化，并使胞內區(qū)的TIR區(qū)域構象發(fā)生變化。MyD88羧基端與TIR區(qū)域結合，氨基端的死亡片段可與IL-1相關蛋白激酶(IRAK)結合，導致IRAK發(fā)生自身磷酸化。磷酸化的IRAK與胞質內的TNF受體相關因子6(TRAF6)結合，介導兩種不同的信號轉導通路。一條通路通過激活轉化生長因子活化激酶1(TAK1)提高核因子抑制蛋白(IκB)激酶復合物活性(IKK)，作用于IκB使之磷酸化、泛素化最終被降解從而活化核因子 κB(NF-κB)。NF-κB 轉運到胞核其活性二聚體可啟動 TNF-α、IL-6、IL-8和IL-12p40等炎癥介質釋放。另一通路則通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族，包括cjun氨基末端激酶、p38和細胞外信號調節(jié)激酶，最終活化轉錄激活蛋白1(AP-1)，而AP-1有刺激細胞增生、轉化和死亡的作用。

MyD88非依賴性信號途徑 主要通過Toll樣受體相關的干擾活化子(TRIF)相關接頭蛋白分子(TRAM)引起NF-κB遲發(fā)激活和干擾素調節(jié)因子3(IRF-3)激活?；罨疘RF-3誘導包括β干擾素在內的一系列基因的轉錄，如可誘導干擾素誘導蛋白10、糖皮質激素衰減反應基因16、干擾素調節(jié)基因1表達和樹突狀細胞的成熟。

TLR4信號通路與膿毒癥炎癥因子調控 LPS與巨噬細胞或樹突狀細胞表面TLR4結合后，通過MyD88依賴性或非依賴性反應通路激活NF-κB。NF-κB進入胞核調控產生一系列前炎癥介質如TNF-α、IL-1，繼而產生大量繼發(fā)性炎癥介質如IL-6、IL-8;同時調控CD80、CD86等輔助刺激因子表達，在輔助刺激因子幫助下，初始T細胞分化為Th1和Th2誘導體液免疫和細胞免疫［15］。TLR4胞內信號通路產生的炎癥介質可進一步激活NF-κB，形成正反饋的級聯(lián)放大效應，產生過度的炎癥反應，嚴重時產生SIRS，最終導致膿毒癥及多臟器功能障礙綜合征。

TLR4信號通路與膿毒癥性AKI

TLR4不僅表達于固有免疫細胞(如單核細胞、中性粒細胞及樹突狀細胞)表面，也在腎臟遠曲和近曲小管上皮細胞、包曼囊上皮細胞及腎血管內皮細胞表達［16］。大量研究顯示TLR4在膿毒癥發(fā)病中的重要性，但TLR4與膿毒癥性AKI的相關研究卻不多。盲腸結扎穿孔可誘發(fā)多種微生物感染而導致膿毒癥發(fā)生，在該動物模型中研究發(fā)現(xiàn)TLR4在近曲小管及遠曲小管上皮細胞、腎小球、腎血管表達顯著增加［17］。C3H/HeJ小鼠由于 TLR4基因第3個外顯子發(fā)生了點突變，導致其編碼的蛋白質多肽鏈第712位組氨酸由脯氨酸代替，從而改變了TLR4信號通路。注射0.25mg LPS后24h監(jiān)測血尿素氮水平，未發(fā)現(xiàn) C3H/HeJ小鼠有 AKI征象，在注射LPS 2h后C3H/HeJ小鼠外周血也未檢出TNF-α，且腎組織中性粒細胞浸潤及腎臟細胞凋亡更罕見［18］。

以上研究支持TLR4參與膿毒癥性AKI的發(fā)生，而TLR4在腎臟細胞及腎外細胞均有表達，El-Achkar等［19］認為內毒素通過兩種途徑造成腎小管上皮細胞及腎血管內皮細胞損傷。除了與固有免疫細胞TLR4結合后釋放系統(tǒng)性炎癥因子間接作用于腎臟引起損傷，還可作用于腎小管上皮細胞及內皮細胞TLR4，引起局部炎癥反應和氧化應激，直接造成腎臟損傷。Cunningham等［18］認為腎外 TLR4在內毒素誘導腎臟損傷中起主要作用，而腎臟TLR4僅在LPS誘導的TNF-α介導的腎小管及血管細胞凋亡發(fā)揮較小的作用。該研究將C3H/HeJ小鼠腎臟交叉移植給野生型小鼠后，小鼠血尿素氮水平升高明顯，而將野生型小鼠腎臟移植給C3H/HeJ小鼠后，小鼠雖然出現(xiàn)血尿素氮水平升高，但較升高幅度明顯低于前者，可抵抗LPS誘導腎臟損傷。

阻斷TLR4通路治療膿毒癥AKI

瑞沙托維(TAK-242) TAK-242化學名稱(6R)-6-［(2-氯-4-氟苯基)胺］磺?；?1-環(huán)己烷-1-羧酸乙酯，分子式 C15H17CIFNO4S，分子量361.82。TAK-242是小分子TLR4信號通路抑制劑，可直接與TLR4胞內結構域TIR半胱氨酸(Cys)747結合，抑制TIR與其接頭蛋白如Toll/IL-1受體銜接蛋白(TIRAP/Mal)、TRAM結合，從而阻斷TIRAP介導的NF-κB及TRAM 介導的NF-κB、干擾素等激活，最終抑制 NO、TNF-α、IL-6等多種細胞因子產生［20-22］。

Fenhammar等［23］通過隨機對照研究，首次探討了TAK-242對膿毒癥時腎功能的保護作用。因人類的TLR4與羊相似，故該作者選擇20只成年特克塞爾雜交羊為實驗動物，通過24h持續(xù)注射LPS［3μg/(kg·h)］誘導膿毒癥模型。實驗組首先靜脈推注2mg/kg TAK-242，后續(xù) 4mg/(kg·d)維持。結果發(fā)現(xiàn)，注射LPS后動物出現(xiàn)低血壓，心動過速，心臟指數(shù)下降，同時出現(xiàn)尿量及肌酐清除率下降，血肌酐、尿素氮、乳酸鹽水平升高。與對照組相比，TAK-242顯著改善血壓，尿量和肌酐清除率，同時血肌酐、尿素氮、乳酸鹽水平及尿NAG水平顯著下降。該研究表明在出現(xiàn)AKI前使用TAK-242可減輕LPS誘導的羊腎臟損傷。同時提出需更進一步研究TLR4激活后導致AKI的完整機制，及TLR4抑制劑是否能逆轉已經存在的AKI，阻斷TLR4信號是否能有效保護細菌感染導致的AKI。

在Ⅰ期臨床試驗中，健康受試者注射TAK-242可抑制TNF-α、IL-1和IL-6產生，伴發(fā)輕度溶血及高鐵血紅蛋白血癥，但無臨床意義［24］。近期 Rice等［25］進行了隨機雙盲安慰劑對照試驗，其目的在于確定TAK-242降低細胞因子的最佳給藥方案，評估藥物療效及安全性。共納入93個重癥監(jiān)護中心274例嚴重膿毒癥、休克或呼吸衰竭患者，分為安慰劑組、低劑量 TAK-242 組［1.2mg/(kg·d)］、高劑量TAK-242組［2.4mg/(kg·d)］。遺憾的是，該研究發(fā)現(xiàn)無論低劑量組還是高劑量組均未抑制IL-6水平;28d全因死亡率高劑量組低于安慰劑組(17.4%vs 24.2%;P=0.26)，但低劑量組與安慰劑組類似(22.0%vs 24.2%;P=0.73)。該研究結果表明TAK-242治療耐受性良好，但未能顯著提高生存率。由于研究第一階段觀察到IL-6水平無明顯下降即停止納入患者，研究對象數(shù)量相對較少，因此TAK-242能否改善人類的生存率尚無明確結論。未來需要大樣本、前瞻、隨機臨床試驗確定TAK-242是否確實能提高膿毒性休克和呼吸衰竭患者的死亡率［25］。

依立托侖四鈉(E5564)E5564化學名稱3-O-癸基-2-脫氧-6-O-［2-脫氧-3-O-［(3R)-3-甲氧基癸基］-6-O-甲基-2-［(11Z)-1-氧代-11-十八烯基］氨基-4-O-磷?；?β-D-吡喃葡萄糖］-2-［(1，3-二氧代十四烷基)氨基］-α-D-吡喃葡萄糖 1-(二氫磷酸)，分子式:C66H122N2O19P2.4Na，分子量1 401.59。LPS 由脂質A、核心多糖和O抗原三部分組成，其中脂質A為主要毒性成分，結構保守。E5564是人工合成類球紅桿菌LPS脂質A結構類似物，直接與MD-2的疏水口袋結合，與脂質A競爭性結合同一位點，從而防止TLR4二聚體形成和細胞內信號轉導［26，27］。

研究表明TLR4參與并介導腎臟缺血再灌注損傷(RIRI)過程［28］。Liu等［29］建立 SD 大鼠 RIRI模型予E5564治療，而對照組給予生理鹽水治療，觀察各組的腎功能情況、腎組織光鏡病理，并測定檢測腎組織炎癥因子趨化因子的表達。結果E5564可有效地抑制中多種炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表達，減輕腎組織的損傷程度。與RIRI類似，TLR4參與膿毒癥條件下AKI的炎癥反應，因此E5564同樣可以減輕膿毒癥腎臟損傷。

體外實驗證實，E5564可抑制LPS刺激的人類、小鼠、大鼠、豚鼠來源的單核巨噬細胞等，多種細胞產生 IL-1β、TNF-α、IL-6 和 IL-8等細胞因子［30］。

Ⅰ期臨床試驗已證實E5564的安全性和耐受性［31］。一項前瞻隨機雙盲安慰劑對照的多中心，劑量增加的Ⅱ期臨床試驗，觀察E5564是否降低嚴重膿毒癥患者28d死亡率。共納入300例患者，分安慰劑組，低劑量組(45mg，2次/d，共6d)，高劑量組(105mg，2次/d，共6d)。三組膿毒癥患者合并急性腎損傷比率分別為 21.9%，17.5%，20.2%。研究發(fā)現(xiàn)在APACHEⅡ評分高的危重患者高劑量治療組死亡率低于安慰劑組(33.3%vs 56.3%，P=0.105)，表明E5564具有較好耐受性，在嚴重膿毒癥患者及預測高死亡率患者，高劑量E5564可降低死亡率［32］。一項關于國際性多中心嚴重膿毒癥患者靜脈注射105mg E5564的臨床Ⅲ期研究已經結束，其結果及相關數(shù)據(jù)正在進一步統(tǒng)計分析中(NCT00334828)。

小結:TLR4在膿毒癥性AKI中發(fā)揮了重要的致病作用，TLR4信號通路可成為膿毒癥性AKI治療的新靶點。目前TLR4阻斷劑治療膿毒癥已經進入Ⅲ期臨床試驗，但是這些研究并未顯著改善患者的生存率，尚有待進一步擴大樣本以證實其用法和臨床療效。

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