朱夢(mèng)麗，朱乾坤，鄒嘉欣，馮沛春，范高韜，王萬(wàn)軍

(西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都610031)

凝集素(lectin)［1］是一種非免疫源性蛋白，能專一識(shí)別特定的糖類并與之可逆共價(jià)結(jié)合，形成可使細(xì)胞凝集的糖蛋白，廣泛分布于植物，動(dòng)物和微生物中。植物凝集素存在于很多植物的種子和營(yíng)養(yǎng)組織中，根據(jù)氨基酸序列的同源性及其進(jìn)化關(guān)系，可以分為7個(gè)家族:豆科凝集素、單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素(Monocot mannose-binding lectin，MBL)、含橡膠素結(jié)構(gòu)域的幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素、II型核糖體失活蛋白、葫蘆科韌皮部凝集素、木菠蘿素相關(guān)凝集素和莧科凝集素［2］。單子葉植物MBL存在于石蒜科、百合科、蘭科等植物中，可特異結(jié)合甘露糖。甘露糖在植物中的分布很少，但卻廣泛分布于昆蟲(chóng)、病毒、細(xì)菌、真菌的表面，當(dāng)植物組織受昆蟲(chóng)或高等動(dòng)物襲擊時(shí)，MBL就從受襲擊的細(xì)胞中釋放至捕食者的消化道，通過(guò)消化道細(xì)胞上的糖類結(jié)合引發(fā)毒性效應(yīng)，凝集素隨食物進(jìn)入昆蟲(chóng)腸道后，就可結(jié)合到這些糖蛋白的受體上，阻礙昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至殺死昆蟲(chóng);MBL還可與微生物表面的甘露糖等糖類結(jié)合，干擾其細(xì)胞壁的合成，影響其細(xì)胞的正常代謝［2-3］。因此，MBL在植物抵御害蟲(chóng)，病原微生物和植食性動(dòng)物中起重要作用。已有研究將外源MBL(如雪花蓮MBL)基因?qū)胨尽煵?、棉花、甘蔗、油菜等?］作物中，培育出抗蟲(chóng)新品種。有研究表明，一些植物MBL(如雪花蓮MBL，洋水仙MBL)對(duì)人類免疫缺陷病毒和貓免疫缺陷病毒顯示抑制活性［5］。

單子葉植物鐵皮石斛(Dendrobium officinale)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)植物，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，具有傷中、除痹、下氣、久服厚腸胃等功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，鐵皮石斛具有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖和提高免疫等作用［6］。野生鐵皮石斛生長(zhǎng)環(huán)境苛刻，加之長(zhǎng)期無(wú)節(jié)制采摘，已是瀕危藥材?；谥参颩BL的重要作用，陳中海等［7］克隆了鐵皮石斛甘露糖結(jié)合凝集素(Dendrobium officinale mannose-binding lectin，DOL)基因的cDNA序列并推導(dǎo)出其編碼的氨基酸(amino acid，AA)序列。本文在此基礎(chǔ)上對(duì)DOL進(jìn)行同源建模，分子對(duì)接和動(dòng)力學(xué)模擬，以進(jìn)一步研究DOL的結(jié)構(gòu)特征及其與甘露糖的作用機(jī)制，為研究鐵皮石斛的藥效及新品種的選育提供信息。

1 材料與方法

1.1 序列分析與同源建模

DOL前體氨基酸序列［7］來(lái)源于NCBI GenBank，序列登錄號(hào)為AAV66418。DOL與相關(guān)MBL的氨基酸序列比對(duì)和同源性分析采用DNAMAN［8］完成。DOL同源建模采用的模板為洋水仙MBL［9］(Narcissus pseudonarcissus mannose-binding lectin，NPL)，與DOL的同源一致性為57%，其晶體結(jié)構(gòu)來(lái)源于PDB，PDB登錄號(hào)為3DZW，通過(guò)X射線晶體學(xué)解析，分辨率達(dá)到 1.7 A。DOL的同源建模采用SWISS-MODEL［10］(http://swissmodel.expasy.org/)的項(xiàng)目模式(Project mode)完成。

1.2 動(dòng)力學(xué)模擬

DOL模型分子動(dòng)力學(xué)(Molecular dynamics，MD)模擬采用 Discovery StudioTM(DS)2.0［11］(Accelrys，San Diego，USA)中基于CHARMm力場(chǎng)的Simulation模塊完成:將整個(gè)體系加入5 ? TIP3P水分子，先采用最陡下降法(Steepest descent，SD)進(jìn)行1 000步能量最小化，收斂標(biāo)準(zhǔn)為0.1 kJ/mol，再用共軛梯度法(Conjugate gradient，CG)進(jìn)行2 000步能量?jī)?yōu)化，收斂標(biāo)準(zhǔn)為0.05 J/mol。系統(tǒng)再?gòu)?0 K進(jìn)行100 ps加熱到300 K，在300 K進(jìn)行200 ps平衡。最后在1 atm 300 K條件下以NPT系統(tǒng)進(jìn)行2 000 ps采樣，選擇保存1 000個(gè)構(gòu)象。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)質(zhì)量檢測(cè)采用PROCHECK［12］(http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVS/)和DS Verify Protein(Profiles-3D)工具完成。

1.3 分子對(duì)接

由于DOL與NPL具有相同的配體甘露糖，而NPL的復(fù)合結(jié)構(gòu)中已含有甘露糖，所以DOL的分子對(duì)接配體就采用NPL的配體甘露糖。DOL與配體甘露糖的分子對(duì)接采用DS CDOCKER對(duì)接模塊完成，對(duì)接范圍采用球形，半徑10 ?，其他參數(shù)默認(rèn)。將得到的配體構(gòu)象進(jìn)行成簇分析(成簇參數(shù)為0.5 ?)，最后依據(jù)成簇情況和最低結(jié)合能來(lái)選取合理的對(duì)接結(jié)果。對(duì)接形成的復(fù)合物模型進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，模擬參數(shù)同DOL模型，對(duì)接結(jié)果用Ligplot程序分析［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 DOL 序列分析

DOL前體(Precursor)氨基酸序列全長(zhǎng)165 AA，通過(guò)NCBI BLAST以DOL為提交序列搜索蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)得到同源性最高的3條MBL前體序列和3條結(jié)構(gòu)已解析的MBL成熟蛋白序列(mat-peptide)，3 條前體序列分別為對(duì)葉蘭［14］MBL(Listera ovata mannose-binding lectin，LOL)、生 姜［15］MBL(Zingiber officinale mannose-binding lectin，ZOL)、紅花石蒜［16］MBL(Lycoris radiata mannose-binding lectin，LRL)，GenBank 登 錄號(hào) 依次 為 AAC37422、AAV70492、BAD98797，與DOL前體序列的同源一致性分別為53%、50%、49%;3條成熟蛋白序列分別為洋水仙［9］MBL(Narcissus pseudonarcissus mannose-binding lectin，NPL)、雪花蓮［17］MBL(Galanthus nivalis mannose-binding lectin，GNL)、天麻［18］MBL(Gastrodia elata mannose-binding lectin，GEL)、PDB登錄號(hào)依次為3DZW、1MSA、1XD5，與DOL的同源一致性分別為57%、54%、47%。

用DNAMAN將DOL與得到的六條序列進(jìn)行多序列比對(duì)(見(jiàn)圖1)。分析結(jié)果顯示，DOL同其他三種植物的MBL前體序列一樣均存在信號(hào)肽(1-24 AA)，成熟蛋白區(qū)域(Maturation peptide region)(25-134 AA)和C端切除肽(135-165 AA)。成熟蛋白區(qū)包含3個(gè)識(shí)別甘露糖所必需的甘露糖結(jié)合部位(Mannose-binding domain，MBD)(MBD1:50-58 AA，MBD2:81-89 AA，MBD3:116-124 AA)，構(gòu)成了一個(gè)特征序列QXDXNXVXY。3個(gè)保守基序中的甘露糖結(jié)合位點(diǎn)為依次為“50、52、54、56、58”，“81、83、85、87、89”，“116、118、120、122、124”。

圖1 DOL與其他6種植物MBL的多序列比對(duì) LOL，ZOL，LRL為前體序列;NPL，GNL，GEL為結(jié)構(gòu)已解析的成熟蛋白Fig.1 The multiple sequence alignment between DOL and six MBLs from different plants LOL，ZOL，LRL are precursor sequences;NPL，GNL，GEL are maturation proteins and their crystal structures were resolved

2.2 DOL 同源建模

根據(jù)2.1的分析結(jié)果，同源建模采用的DOL序列是DOL成熟蛋白序列(25-134 AA)，選定的模板為NPL成熟蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。以NPL為模板用SWISSMODEL構(gòu)建DOL的三維結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖2)，將DOL與模板NPL結(jié)構(gòu)進(jìn)行疊合比較，二者的結(jié)構(gòu)具有很高的相似性，其疊合的均方根差(RMSD)為0.77 ?，二者結(jié)構(gòu)均由11個(gè)β-折疊區(qū)與12個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)構(gòu)成，除N端一個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)只有部分重疊和92-93 AA處產(chǎn)生3個(gè)空位以外，其他各區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)基本重疊。DOL的三維結(jié)構(gòu)呈中空的三棱柱結(jié)構(gòu)，棱柱3個(gè)側(cè)面由β-折疊構(gòu)成，分別為 sheet 3-6，sheet 2/7-9，sheet 1/10-11。3個(gè)MBD分別位于3個(gè)側(cè)面的coil 5和 sheet5、coil 8 和 sheet 8、coil 11 和 sheet 11。

2.3 DOL模型動(dòng)力學(xué)模擬

為研究DOL模型的穩(wěn)定性，上述得到的同源模型需要進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬。動(dòng)力學(xué)模擬軌跡的均方根偏差(Root mean square，RMSD)是衡量一個(gè)體系是否穩(wěn)定的重要依據(jù)，為了檢測(cè)動(dòng)力學(xué)軌跡的穩(wěn)定性，對(duì)復(fù)合物中DOL骨架原子的均方根偏差進(jìn)行了分析，如圖3(a)所示，DOL骨架原子的 RMSD在開(kāi)始階段呈上升趨勢(shì);在大約800 ps之后，軌跡平穩(wěn)已達(dá)到平衡且 RMSD值一直穩(wěn)定在2.5 ?左右，軌跡略有波動(dòng)。

圖2 DOL結(jié)構(gòu)和模板NPL結(jié)構(gòu)的疊合Fig.2 The superimposition between the monomer structure of DOL and that of template NPL

此外，在大約1 000 ns的MD模擬之后，體系勢(shì)能也趨向最小值而達(dá)到穩(wěn)定。均方根波動(dòng)(Root mean square fluctuation，RMSF)是反應(yīng)蛋白質(zhì)的柔性和穩(wěn)定性的一個(gè)重要參數(shù)，如圖3(b)所示，DOL的N端25-125位置的氨基酸RMSF值都在2.0 ?以下，氨基酸比較穩(wěn)定，只有49、69、82、94略顯波動(dòng)。DOL的柔性區(qū)域主要集中在其C端(125-136)(見(jiàn)圖3(b))，該區(qū)主要是無(wú)規(guī)則卷曲，從三棱柱上延伸出來(lái)(見(jiàn)圖2)。

圖3 (a)DOL模型C骨架的RMSD曲線;(b)DOL氨基酸殘基的RMSF曲線Fig.3 (a)The RMSD curve of DOL model backbone;(b)the RMSF curve of DOL residue

2.4 DOL 結(jié)構(gòu)檢驗(yàn)

DOL結(jié)構(gòu)用PROCHECK進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，如圖4(a)的Ramachandran圖所示，在參與建模的112個(gè)氨基酸殘基中，在允許范圍之內(nèi)的占96.9%。不合理區(qū)的氨基酸殘基Arg95、Leu60、Asp43，這3個(gè)殘基均在功能位點(diǎn)之外，不影響后續(xù)研究。優(yōu)化后的DOL進(jìn)一步用Profiles-3D進(jìn)行檢測(cè)，如圖4(b)的Verify-3D圖所示，98%以上的氨基酸殘基的分值均在0以上，只有C端有兩個(gè)氨基酸(Arg135，Phe136)分值在0以下。PROCHECK和Verify-3D結(jié)果表明，得到的DOL結(jié)構(gòu)合理，可進(jìn)一步進(jìn)行后續(xù)研究。

2.5 DOL與配體的分子對(duì)接

基于上述分析的活性位點(diǎn)，利用DS Binding Site tools將甘露糖的對(duì)接范圍(對(duì)接半徑10 ?)定位于3個(gè)甘露糖結(jié)合部位 (MBD1:50-58AA，MBD2:81-89AA，MBD3:116-124AA)。用 DS從 NPL晶體結(jié)構(gòu)中分離出所需配體甘露糖的三維結(jié)構(gòu)。用DS CDOCKER將甘露糖對(duì)接于相應(yīng)的位置，得到了DOL和甘露糖的復(fù)合結(jié)構(gòu)。如圖5所示，3個(gè)甘露糖Man1，Man2，Man3 分別作用于 MBD1，MBD2，MBD3三個(gè)結(jié)合部位，其相互作用能分別為 -64.71 kJ.mol-1、-69.19 kJ.mol-1、-56.5 kJ.mol-1。從相互作用能來(lái)看，MBD1，MBD2與甘露糖的結(jié)合要強(qiáng)于MBD3(見(jiàn)表1)。

圖4 (a)DOL模型的Ramachandran圖;(b)DOL模型的Verify-3D圖Fig.4 (a)The Ramachandran plot of DOL model;(b)the Verify-3D curve of DOL modelIn

圖5 DOL與甘露糖的復(fù)合結(jié)構(gòu)Fig.5 The complex structure of DOL and mannobioses

表1 DOL和甘露糖間的范德華力(Evdw)，靜電作用(Eele)和總的相互作用能(Etotal)Table 1 The van der Waal energy(Evdw)，electrostatic energy(Eele)and Total energy(Etotal)between DOL and Mannobioses

為了研究對(duì)接復(fù)合物的穩(wěn)定性，得到的對(duì)接模型進(jìn)行了2 000 ps的動(dòng)力學(xué)模擬。整個(gè)復(fù)合物的RMSD曲線如圖6所示，復(fù)合物在750 ps左右開(kāi)始趨向于平衡，RMSD值維持在2.2 ?左右，略有波動(dòng)。與前面的DOL空蛋白的動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程相比可知，由于復(fù)合物中存在三個(gè)配體，使得其RMSD值降低，表明甘露糖與DOL結(jié)合可以穩(wěn)定復(fù)合物結(jié)構(gòu)。另外，3個(gè)甘露糖 Man1、Man2、Man3的 RMSD最大值分別為 1.12 ?、1.06 ?、1.34 ?，平均 值分別 為0.82 ?、0.80 ?、0.97 ?，說(shuō)明三者在動(dòng)力學(xué)過(guò)程中與DOL結(jié)合的很牢靠，沒(méi)有脫離DOL結(jié)合部位［19］。其中Man3的RMSD值略偏高，說(shuō)明DOL上的MBD1和MBD2較MBD3更利于甘露糖結(jié)合。

在對(duì)接的復(fù)合物中，3個(gè)MBD結(jié)構(gòu)相似，都有一個(gè)配體與之結(jié)合。甘露糖通過(guò)范德華力和氫鍵作用特異性地結(jié)合于3個(gè)MBD(見(jiàn)圖7)。從圖7(a)、(b)、(c)可以看出，在三組甘露糖結(jié)合殘基中與甘露糖直接發(fā)生氫鍵作用的都是Gln、Asp、Asn和Tyr，而Val都沒(méi)與之發(fā)生氫鍵作用?？梢?jiàn)在與甘露糖結(jié)合的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的為Gln、Asp、Asn和Tyr。甘露糖上參與形成氫鍵作用的基團(tuán)為氧原子。MBD1、MBD2和MBD3與甘露糖的結(jié)合都是甘露糖的O分別與Asp、Gln、Tyr、Asn形成氫鍵。甘露糖上MBD1和MBD2與甘露糖的結(jié)合方位相似(見(jiàn)圖7(a)、(b))，但是由于結(jié)合部位中其它氨基酸的影響，所以氫鍵距離和總的結(jié)合能有所區(qū)別。

圖6 DOL和甘露糖對(duì)接復(fù)合物的RMSD曲線Fig.6 The RMSD curve of docking complex of DOL and Mannobioses

圖7 DOL的MBD氨基酸殘基與甘露糖的相互作用Fig.7 The interactions between the MBD residues of DOL and mannobiose

在MBD1(見(jiàn)圖7(a))中，Gln50 NE(2)與甘露糖O4和 O(10)、Asp52 OD(2)與甘露糖 O(10)、Asn54 ND(2)與甘露糖O(10)、Tyr58 OH與甘露糖O(3)形成氫鍵，氫鍵供體原子間距分別為3.24 ?、3.16 ?、2.77 ?、3.13 ?、2.74 ?。 在 MBD2(圖7(b))中，Gln81 NE2與甘露糖O(4)和O(10)、Asp83 OD(2)與甘露糖O(10)、Asn85 ND(2)與甘露糖O(2)和O(10)、Tyr89 OH與甘露糖O(3)形成氫鍵，氫鍵供體原子間距分別為 3.21 ?、2.94 ?、2.54 ?、3.32 ?、3.13 ?、3.32 ?。MBD2 中除了氫鍵，還有Asp105與甘露糖 C1產(chǎn)生靜電作用。在 MBD3(見(jiàn)圖7(b))中，Gln116 NE(2)與甘露糖 O(8)、Asp118 OD(2)與甘露糖O(9)、Asn85 ND(2)與甘露糖O(9)、Tyr124 OH與甘露糖O(3)形成氫鍵，氫鍵供體 原 子 間 距 分 別 為 3.05 ?、2.69 ?、3.05 ?、2.85 ?。綜上，MBD2 由于 Gln81、Asp83、Asn120、Tyr89的氫鍵和Asp105的靜電作用，其與甘露糖的結(jié)合要強(qiáng)于MDB1和MBD3，而MBD3與甘露糖的結(jié)合較MBD1和MBD2弱。

3 討論

本文分析了DOL前體序列的信號(hào)肽(1-24 AA)和C端切除肽(135-165 AA)，獲得了DOL成熟肽(25-134 AA)。通過(guò)序列分析得到DOL上的甘露糖結(jié)合部位 QXDXNXVXY(50-58 AA，81-89 AA，116-124 AA)。以NPL為同源模板建立了DOL的三維結(jié)構(gòu)模型，DOL呈中空的三棱柱結(jié)構(gòu)，三棱柱的3個(gè)側(cè)面主要由β折疊構(gòu)成，3個(gè)側(cè)面各有一個(gè)甘露糖結(jié)合基序。根據(jù)分析的活性位點(diǎn)確定DOL的配體對(duì)接部位，將甘露糖對(duì)接進(jìn)DOL結(jié)構(gòu)中建立了DOL與甘露糖的復(fù)合結(jié)構(gòu)。通過(guò)分子對(duì)接結(jié)果和動(dòng)力學(xué)分析表明，結(jié)合區(qū)50-58 AA和81-89 AA對(duì)甘露糖的結(jié)合能力要強(qiáng)于116-124 AA，在與甘露糖結(jié)合的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的氨基酸殘基為Gln、Asp、Asn和Tyr。另外，由于81-89 AA與甘露糖的結(jié)合作用最強(qiáng)，因此可以試圖通過(guò)點(diǎn)突變的方式，將50-58 AA和116-124 AA突變成81-89 AA的模式，構(gòu)建突變基因培育轉(zhuǎn)基因植物，同時(shí)也能進(jìn)一步研究突變蛋白的藥理作用。

單子葉甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)在農(nóng)業(yè)抗病蟲(chóng)害上的成功應(yīng)用引起了人們的廣泛關(guān)注，本文DOL的同源建模與分子模擬研究為在分子水平上解釋DOL的功能提供依據(jù)，對(duì)研究鐵皮石斛抗病毒，抗蟲(chóng)害有關(guān)的基因，通過(guò)基因工程等手段獲得鐵皮石斛新品種具有重要意義。另外，已有研究發(fā)現(xiàn)MBL對(duì)人類或動(dòng)物逆轉(zhuǎn)錄病毒具有抑制作用，如雪花蓮凝集素和洋水仙凝集素對(duì)人類免疫缺陷病毒和貓免疫缺陷病毒顯示抑制活性［5］，本研究以單子葉植物鐵皮石斛的MBL為研究對(duì)象，分析了DOL與甘露糖的作用位點(diǎn)和作用機(jī)制，可為凝集素抗病機(jī)理及凝集素相關(guān)藥物研究奠定基礎(chǔ)。

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