張 茜，郭夏麗，陳 濱，吳學(xué)志，戴喜末，羅麗萍

南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，南昌330031

不同來源中國蜂膠水提物的化學(xué)組成及抗氧化性

張 茜，郭夏麗，陳 濱，吳學(xué)志，戴喜末，羅麗萍*

南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，南昌330031

本文研究了季節(jié)和地理來源對中國蜂膠水提物的化學(xué)成分和抗氧化性的影響。分別采集了來自山東、湖北和海南三個省份不同季節(jié)的蜂膠，采用改進(jìn)的提取方法，得到蜂膠水提物(Water extract of propolis，WEP)。分光光度法測定了WEP的主要化學(xué)組成，普魯士蘭法和清除DPPH自由基活性法評價了WEP的抗氧化性。研究結(jié)果表明，中國WEP含有總酚和總黃酮等化學(xué)成分，具有較好的抗氧化性。季節(jié)對中國WEP化學(xué)成分和抗氧化性有顯著影響。山東和湖北WEP化學(xué)成分比較接近，但同海南WEP有顯著差異，抗氧化活性也顯著強(qiáng)于海南WEP。不同產(chǎn)地和不同采收季節(jié)的中國WEP存在化學(xué)組成及生物活性多樣性，在生產(chǎn)實踐中需注意這一特性。

蜂膠;水提物;化學(xué)組成;抗氧化性

蜂膠(propolis)是蜜蜂從植物的樹芽、樹皮等部位采集的樹脂，再混以蜜蜂舌腺、蠟腺等腺體的分泌物，經(jīng)蜜蜂加工轉(zhuǎn)化而成的一種膠狀物質(zhì)。其基本成分是50%的樹脂(類黃酮和相關(guān)的酚酸)、30%的蠟、10%的揮發(fā)油、5%的花粉和5%的其他有機(jī)成分［1，2］。受膠源植物的影響，蜂膠，特別是來自溫帶和熱帶的蜂膠，化學(xué)組成存在顯著差異［3］。由于蜂膠的多數(shù)有效成分容易被醇提取，所以關(guān)于蜂膠醇提物的研究報道很多［4，5］。而對蜂膠水提物(Water extract of propolis，以下簡稱為WEP)的研究報道較少，且研究對象多為巴西蜂膠。巴西綠蜂膠由于性質(zhì)特殊，用水可以得到更充分的提?。?］，其WEP含有大量的酚酸類化合物。Arjun系統(tǒng)地對比研究了不同國家蜂膠的醇提物和水提物，結(jié)果表明，巴西和中國蜂膠的WEP(未說明具體的地區(qū))比其醇提物有更強(qiáng)的DPPH清除能力，而秘魯和荷蘭蜂膠醇提物的DPPH清除能力強(qiáng)于其WEP［7］。WEP具有保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗菌等活性［8-10］，且可避免醇提物的副作用［11］，具有很好的應(yīng)用前景。但目前關(guān)于中國WEP化學(xué)組成的研究報道還很少［12］。

由于膠源植物不同，導(dǎo)致蜂膠的化學(xué)組成和生物活性具有多樣性［4，5］。陳裕文等研究表明，季節(jié)是影響臺灣蜂膠酚類成分的主要生態(tài)因子［13］。Bankova研究了不同季節(jié)巴西蜂膠的化學(xué)成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二萜類化合物僅在夏季開始出現(xiàn)，秋季含量達(dá)最高，其他季節(jié)不存在。但Sforcin的研究結(jié)果又表明，季節(jié)對巴西蜂膠醇提物的化學(xué)組成和抑菌活性沒有顯著影響［8，9］。綜合已有報道可知，季節(jié)和采集地對蜂膠的影響不能一概而論，為明確這兩個因子對中國蜂膠WEP的影響，本文以分別來自中國三個不同地區(qū)及不同季節(jié)的蜂膠為實驗材料，較為系統(tǒng)地研究了WEP的化學(xué)組成和抗氧化活性。研究結(jié)果有助于指導(dǎo)生產(chǎn)實踐和對中國蜂膠多樣性的理解。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂膠原膠：采集地和時間分別為山東濟(jì)寧(6～9月，每月一次，共4個樣，分別命名為SD-1～SD-4)、湖北隨州(6～9月，每月一次，共4個樣，分別命名為HB-1～HB-4)和海南海口(采集時間為5月上旬、中旬和下旬、6月中旬、7月中旬和下旬、8月和10月，共8個樣，分別命名為HN-1～HN-8)。將原膠置于-18℃冷凍變硬變脆后，用木錘敲打砸成小碎塊，用藥材粉碎機(jī)粉碎后，放于-18℃中備用。2，4-二硝基苯肼;鐵氰化鉀;0.2 M pH 6.6的PBS緩沖液;DPPH(Sigma);其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700pharmaSpec紫外-可見分光光度計：SHIMADZU，日本;SHB-IIIA型循環(huán)水式多用真空泵：河南太康教材儀器廠;美國Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括在線脫氣裝置，四元泵，柱溫箱，光電二極管陣列檢測器(DAD)，G2170BA LC化學(xué)工作站。

1.3 實驗方法

1.3.1 WEP的提取及配制

對Suzuki［10］蜂膠水提取方法進(jìn)行了改進(jìn)。具體方法是：取10.0 g蜂膠在300 mL蒸餾水中混勻，60℃水浴提取7 h。提取液離心 (28 000×g)30 min，收集上清液。殘渣采用同樣方法再次提取和離心，合并兩次上清液，于60℃ 真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得固態(tài)WEP。固態(tài)WEP用蒸餾水復(fù)溶，配制成10 mg/mL WEP溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后置于4℃冰箱中保存，待測。

1.3.2 WEP中可溶性糖、總酚、總黃酮、黃酮醇、黃烷酮的測定

硫酸蒽酮法測定可溶性糖：準(zhǔn)確吸取10 μL WEP溶液于試管中，加蒸餾水至1 mL，在冰浴中靜置5 min，再加入4 mL 1 mg/mL蒽酮80%硫酸溶液，在沸水浴中煮沸10 min，取出用流水冷卻，室溫放置10 min，在620 nm處測定吸光值，結(jié)果用mgGlu/g表示。

福林試劑法測定總酚［11］：準(zhǔn)確吸取20 μL WEP溶液于25 mL容量瓶中，加入3 mL福林試劑，再加入2 mL 200 g/L的碳酸鈉水溶液，混勻后用蒸餾水定容，70℃水浴15 min，冷卻至室溫，于760 nm處測定吸光值，結(jié)果以mgGae/g表示。

總黃酮測定［14］：準(zhǔn)確吸取50 μL WEP溶液于25 mL容量瓶中，加入無水乙醇至10 mL，再分別加入100 g/L氯化鋁水溶液0.5 mL，混勻后用蒸餾水定容，室溫靜置15 min后，于415 nm處測定吸光值，結(jié)果用mgRutin/g表示。

黃酮醇測定［15］：準(zhǔn)確吸取100 μL WEP溶液于25 mL容量瓶中，加入95%乙醇至4 mL，再分別加入100 g/L氯化鋁水溶液2.5 mL，及1 moL/L醋酸鉀水溶液2.5 mL?；靹蚝笥谜麴s水定容，室溫靜置15 min后，于415 nm處測定吸光值，以50 g/L氯化鋁水空白溶液作對照，結(jié)果用mgQue/g表示。

黃烷酮測定［15］：準(zhǔn)確吸取1 mL WEP溶液于試管中，加入2 mL甲醇，再加入2 mL 1%的DNPH-硫酸溶液，混勻后于50℃水浴1 h。室溫冷卻后加入5 mL 1% 氫氧化鉀溶液，搖勻，靜置。取上清液1 mL于25 mL容量瓶，甲醇定容，于495 nm波長處測定吸光值，結(jié)果用mgQue/g表示。

1.3.3 HPLC條件［12］

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相為甲醇－0.1%甲酸，梯度洗脫，其時間程序為：0→10→20→30→60→70→75→80 min。甲醇含量：0% →15% →17% →32%→42%→50%→65%→25%，流速：1.0 mL/ min，DAD檢測波長為256 nm和280 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35℃。

1.3.4 WEP的總抗氧化能力［16］

普魯士藍(lán)法：WEP溶液用甲醇分別稀釋成25，50，100，200，400 μg/mL溶液。分別吸取1 mL各濃度樣液加入2.5 mL PBS緩沖液，再加入2.5 mL鐵氰化鉀溶液;50℃水浴20 min后，加入2.5 mL三氯乙酸，搖勻，取7.5 mL樣液，加入同體積雙蒸水，再加入1.5 mL氯化鐵溶液。搖勻，靜置10 min，于700 nm測定吸光值。以蘆丁作為陽性對照。WEP總抗氧化能力以WEP濃度－吸光值線性回歸方程斜率K表示。

1.3.5 WEP清除DPPH自由基活性［17］

將WEP用甲醇分別釋成100，200，300，400，500，600 μg/mL樣液。分別取各濃度樣液0.1 mL，加入3.9 mL 0.1～0.2 mmoL/L DPPH甲醇溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，以0.1 mL甲醇作空白。室溫黑暗條件下靜置90 min后，于517 nm下測定其吸光值。自由基清除率I%=［(A0-AS)/A0］×100。50%抑制濃度IC50可通過自由基清除活性－樣品濃度的線性關(guān)系求出?？寡趸钚杂每寡趸钚灾笖?shù)(AAI)表示。

AAI：抗氧化活性指數(shù);C［DPPH］e：DPPH終濃度，μg/mL;IC50：50%抑制濃度，μg/mL。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)3次重復(fù)，ANOVA進(jìn)行方差分析、樣品平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，SPSS17.0計算相關(guān)性及顯著性水平。利用國家藥典委員會指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)對HPLC圖譜進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 WEP的化學(xué)組成

WEP中可溶性糖、總酚、總黃酮、黃酮醇、黃烷酮的測定結(jié)果見表1。

表1 不同來源蜂膠水提物的化學(xué)組成Table 1 The chemical compositions of water extraction of propolis

不同地區(qū)和季節(jié)WEP的化學(xué)組成存在顯著差異。山東蜂膠WEP以八月(SD-3)總酚含量最高，其次是六月(SD-1)，各月份間差異顯著;可溶性糖含量以六月(SD-1)和九月(SD-4)含量最高，顯著高于七月(SD-2)和山月(SD-3);總黃酮以六月(SD-1)最高，且各季節(jié)間差異顯著;黃烷酮含量除七月(SD-2)的顯著低于其他樣品外，其余三個樣品差異不顯著;黃酮－黃酮醇含量以六月(SD-1)和八月(SD-3)顯著高于其他月份。

湖北蜂膠WEP總酚含量在六月(HB-1)顯著低于月份，其他樣品差異不顯著;可溶性糖含量差異顯著，最高的六月(HB-1)是九月(HB-4)四倍之多;總黃酮含量以七月(HB-2)和九月(HB-4)最高，且顯著高于六月(HB-1)和八月(HB-3);各月份的黃烷酮含量沒有顯著差異;黃酮-黃酮醇含量七月(HB-2)和八月(HB-3)顯著高于另兩個樣品。

海南蜂膠WEP總酚含量最高的是7月下旬(HN-6)，是5月上旬含量的兩倍，其他時間總酚含量差異顯著;各樣品之間總黃酮顯著差異，以5月中旬和6月樣品含量最低;黃酮－黃酮醇以5月上、中旬顯著低于其他樣品;可溶性糖和黃烷酮的差異小于其它指標(biāo)。

將同一地區(qū)不同季節(jié)WEP的各指標(biāo)進(jìn)行平均，結(jié)果見表1、表 3。總酚含量以山東 WEP最高(515.85±85.76 mg/g)，顯著高于湖北，且達(dá)海南WEP的10倍之多;山東和湖北WEP中的黃酮-黃酮醇含量接近，均顯著高于海南;可溶性糖、總黃酮和黃烷酮三個地區(qū)之間沒有顯著差異。

2.2 不同季節(jié)WEP的抗氧化性

山東、湖北和海南不同季節(jié)WEP總抗氧化能力及清除DPPH自由基能力結(jié)果見表2。

表2 不同來源蜂膠水提物總抗氧化能力及清除DPPH自由基能力Table 2 Total antioxidant and DPPH radical reducing activities of water extraction of propolis of different origins

3個地區(qū)不同季節(jié)WEP的總抗氧化能力及清除DPPH自由基能力存在顯著差異。山東九月(SD-4)的總抗氧化活性較低，但清除DPPH能力顯著強(qiáng)于其他樣品;湖北六月(Hu-1)的總抗氧化及清除DPPH能力均顯著低于同地其它月份;海南5月中旬樣品的總抗氧化活性不及同地7月下旬樣品的一半，其他時間的樣品差異也顯著。

將同一地區(qū)不同季節(jié)WEP的抗氧化活性進(jìn)行平均，從平均值來看，總抗氧化活性強(qiáng)弱關(guān)系為山東WEP＞湖北WEP＞海南WEP，三者之間差異顯著。山東和湖北WEP的AAI很高，分別是4.32±0.87和3.77±1.00，Rodrigo［17］指出，當(dāng)AAI＜0.5時，說明清除DPPH活性弱，0.5＜AAI＜1.0時，活性中等，1.0＜AAI＜2.0時，活性較強(qiáng)，當(dāng)AAI＞2.0時，則說明活性很強(qiáng)。按此標(biāo)準(zhǔn)，山東和湖北WEP均具有非常的抗氧化活性;而海南WEP僅為0.14± 0.06，沒有明顯的清除自由基活性。

實驗結(jié)果表明，來著溫帶的山東和湖北蜂膠在成分上同熱帶的海南蜂膠存在顯著差異，且抗氧化活性前二者顯著強(qiáng)于后者。山東和湖北WEP含有非常多的酚類成分，表現(xiàn)出非常強(qiáng)的抗氧化活性，可以作為天然的抗氧化劑，有很高的利用價值。海南WEP中有效活性成分含量較少，抗氧化活性不明顯，使用價值不大。而同為熱帶的巴西WEP有很強(qiáng)的抗氧化活性。這可能與海南和巴西蜂膠膠源植物不同有關(guān)。

從不同地區(qū)和季節(jié)WEP化學(xué)成分和抗氧化活性的結(jié)果看，同一地區(qū)，季節(jié)對蜂膠化學(xué)成分和抗氧化活性的影響是很顯著的。其原因是，同一地區(qū)由于季節(jié)更替，優(yōu)勢植被會發(fā)生相應(yīng)變化，由于膠源植物廣泛，蜜蜂會有選擇性的采取時令植物的分泌物，從而引起蜂膠成分的變化。由于分屬于不同氣候帶，山東、湖北和海南三地的季節(jié)及植被變化特點(diǎn)不同，從而導(dǎo)致所在地蜂膠成分和活性的變化規(guī)律不盡相同。

2.3 山東、湖北和海南蜂膠水提物的HPLC色譜圖相似度

利用指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對分別于256 nm和280 nm下獲得的HPLC圖譜進(jìn)行分析，16個樣品色譜圖存在差異，見圖1和圖2。

圖1 三個地區(qū)蜂膠水提物256 nm下的HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint chromatograms of WEP from three different areas of China at 256 nm

圖2 三個地區(qū)蜂膠水提物280nm下的HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC finger print chromatograms of WEP from three different areas of China at 280 nm

256 nm和280 nm相似度分別在0.030～0.809和0.026～0.844。將山東、湖北和海南三地WEP的圖譜同對照指紋圖譜對比分析相似度表明(表3)，三地圖譜的相似度存在一定差異。其中，山東和湖北差異不顯著，但海南與二者差異顯著。說明地理位置及氣候、植被相似的地區(qū)，具有更為相似的蜂膠具體化學(xué)組成。

表3 不同地區(qū)蜂膠水提物色譜圖相似度Table 3 Similarity of chromatography of water extraction of propolis from different areas

3 結(jié)論

季節(jié)對中國蜂膠水提物的化學(xué)成分和抗氧化性有顯著影響;山東和湖北同屬溫帶，來自這兩地的蜂膠水提物化學(xué)成分和抗氧化性比較接近，它們與熱帶的海南蜂膠差異顯著;中國溫帶地區(qū)蜂膠與熱帶蜂膠水提物比起來具有更為豐富的化學(xué)組成和更強(qiáng)的抗氧化活性;海南和巴西同屬于熱帶，但海南蜂膠抗氧化活性明顯弱于巴西蜂膠，這可能和植被不同有關(guān)。

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Chemical Compositions and Antioxidant Activities of Water Extract of Propolis in Different Seasons and Areas of China

ZHANG Xi，GUO Xia-li，CHEN Bin，WU Xue-zhi，DAI Xi-mo，LUO Li-ping*
School of Life Science and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 330031，China

The aim of this study was to investigate the effects of seasons and collected areas on the chemical composition and antioxidant activity of Chinese propolis.Propolis samples in different seasons from Shangdong(SD)，Hubei(HB) and Hainan(HN)province were collected and underwent the extract procedure by an advanced method and then the water extract of porpolis(WEP)was obtained.The contents of the main chemical compositions of WEP were determined by spectrophotometry，and the antioxidant activities were evaluated by Prussian Blue Method and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)free radical scavenging assay systems.The results showed that WEP in China was abundant in total phenol and total flavonoid，and most WEP had strong antioxidant activity.Seasonal factor had significant impact on the chemical compositions and antioxidant activity of WEP in China.Chemical compositions of WEP from SD and HB Province were similar，but were different from those of WEP from HN Province.Antioxidant activity of the former two WEPs were stronger than the latter.WEP in China collected in different seasons from different provinces varied in terms of chemical compositions and biological activities，which should be taken into account in the practical production process.

propolis;water extracts;chemical composition;antioxidant activity

1001-6880(2012)04-0444-06

2011-06-08 接受日期：2011-11-04

國家自然科學(xué)基金項目(310715510，30700105)

*通訊作者 Tel：86-791-3969519;E-mail：lluo2@126.com

S896.6

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