呂應年，侯英奇，范世錦，茍占平1，#（1.廣東醫(yī)學院廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東湛江540；.中央司法警官學院偵查教研室，河北保定 07007；.廣東醫(yī)學院藥學院，廣東東莞 5808）

刺齒鳳尾蕨抗腫瘤活性成分5F的含量測定Δ

呂應年1＊，侯英奇2，范世錦3，茍占平1，3#（1.廣東醫(yī)學院廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東湛江524023；2.中央司法警官學院偵查教研室，河北保定 073007；3.廣東醫(yī)學院藥學院，廣東東莞 523808）

目的：建立測定刺齒鳳尾蕨中抗腫瘤成分5F含量的方法，并測定其不同部位中5F的含量。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-1%醋酸水溶液（梯度洗脫），流速為1.0mL·min－1，檢測波長為242nm，柱溫為30℃。結(jié)果：5F檢測濃度在6～96μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r＝0.9981）；低、中、高濃度對照品加入量對應的平均加樣回收率分別為103.33%、100.84%、100.39%，RSD分別為5.86%、3.05%、1.02%（n均為6）。5F在刺齒鳳尾蕨葉中含量最高，莖中含量其次，根中含量最低。結(jié)論：本方法穩(wěn)定、快速且雜質(zhì)干擾小，可用于刺齒鳳尾蕨中5F的含量測定。關(guān)鍵詞 刺齒鳳尾蕨；抗腫瘤成分；Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid（5F）；含量測定

刺齒鳳尾蕨系鳳尾蕨科植物刺齒鳳尾蕨Pteris dispar Kunze的干燥全草，具有清熱解毒、止血祛痰的功效，民間用于治療腸炎、痢疾、瘡毒[1]。同屬植物半邊旗（P.semipinnata L.）在分類學上與其比較接近。半邊旗有明顯的抗腫瘤活性[2，3]，其主要活性成分為二萜類化合物[4，5]，其中最主要的是具有α，β-不飽和環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)的貝殼杉烷型二萜Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid（簡稱5F）。根據(jù)藥用植物化學分類學的原理，親緣關(guān)系相近的植物具有相同或相似的化學成分。龔先玲等[6]發(fā)現(xiàn)刺齒鳳尾蕨的提取物對人癌細胞具有明顯的抑制作用；日本學者先前從刺齒鳳尾蕨中分離鑒定出一些與半邊旗中的活性成分相似或相同的化合物，包括5F[7]；筆者從采自廣東韶關(guān)的樣品提取分離鑒定的化合物中也包括5F（化學成分的分離鑒定另文發(fā)表）。為了刺齒鳳尾蕨中抗腫瘤活性成分的合理開發(fā)利用，本試驗建立了以高效液相色譜（HPLC）法測定刺齒鳳尾蕨中5F含量的方法，并比較了根、莖、葉片中5F的含量，以為刺齒鳳尾蕨的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1200型HPLC儀，含G1311A四元泵、G1328B手動進樣器、G1315B二極管陣列檢測器、G1316A柱溫箱（美國安捷倫公司）；AE240型電子天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）；VGT-1860QTD型超聲清洗儀（蘇州江東精密儀器有限公司）。

刺齒鳳尾蕨藥材采自廣東韶關(guān)市樂昌市，經(jīng)廣東醫(yī)學院茍占平教授鑒定為刺齒鳳尾蕨P.dispar Kunze的全草。5F對照品為廣東醫(yī)學院廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室分離純化，由日本東京理工大學藥學部和廣東醫(yī)學院生化研究所鑒定，并經(jīng)HPLC歸一化法計算純度＞96%；甲醇為色譜純，水為三重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm）；檢測波長：242nm；流動相：甲醇（A）-1%醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～4min，40%A；4～10min，40%A→60%A；10～17min，60%A→40%A）；流速：1.0mL·min－1；柱溫：30℃。

2.2 供試品溶液的制備

分別精密稱取3批刺齒鳳尾蕨藥材的根、莖、葉粗粉各約5g，置于250mL錐形瓶中，各加入甲醇50mL，用保鮮薄膜封口，搖勻，置于超聲清洗儀中超聲（頻率：40kHz，功率：180W）提取60min，搖勻后以定性濾紙濾過，濾液再經(jīng)0.45μm濾頭濾過，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取5F對照品1.2mg，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得濃度為0.12mg·mL－1的對照品貯備液。分別精密吸取該貯備液0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80mL，以甲醇定容至1mL，搖勻，即得系列對照品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗

分別取96μg·mL－1的對照品溶液和刺齒鳳尾蕨根、莖、葉的供試品溶液各20μL，注入HPLC儀，記錄色譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在上述色譜條件下5F的出峰時間為12min，供試品在對照品5F峰相應位置處有一顯著色譜峰，表明該色譜系統(tǒng)的適用性和本方法的專屬性均良好。色譜見圖1。

圖1 刺齒鳳尾蕨不同部位提取物與對照品的HPLC圖A.5F對照品；B.根提取物；C.莖提取物；D.葉提取物Fig 1 HPLC chromatograms of extracts in different parts of P.disparA.5F control；B.extract from roots；C.extract from stem；D.extract from leaves

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取上述系列對照品溶液各20μL，進樣測定。以峰面積積分值（Y）對5F的檢測濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程為Y＝14.131X+48.723（r＝0.9981，n＝6）。結(jié)果表明，5F的檢測濃度在6～96μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗

取濃度為72μg·mL－1的對照品溶液20μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果，RSD＝2.71%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗

取刺齒鳳尾蕨的葉粗粉適量，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣20μL，測定樣品中5F的含量。結(jié)果，RSD＝3.16%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量（12μg·mL－1）的同一批刺齒鳳尾蕨的葉粗粉適量，共18份，每6份分別加入低、中、高濃度的5F對照品溶液，制備成濃度分別為12、48、84μg·mL－1的供試品溶液，各進樣20μL，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝18）Tab 1Results of recovery test（n＝18）

2.9 樣品含量測定

分別精密稱取3批刺齒鳳尾蕨藥材的根、莖、葉粗粉各適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液。精密吸取20μL進樣，測定峰面積，代入回歸方程計算樣品中5F的含量，結(jié)果見表2。

表2 刺齒鳳尾蕨不同部位中5F含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2Content determination of 5F in different parts of P.dispar（n＝3）

3 討論

通過對試驗條件的摸索，發(fā)現(xiàn)流動相用甲醇-1%醋酸水溶液進行梯度洗脫，可使5F及各成分得到良好分離。因為5F是二萜類酸性化合物，在經(jīng)過色譜柱時與酸性流動相形成分子狀態(tài)，故加入醋酸可防止拖尾現(xiàn)象。綜上分析，本方法穩(wěn)定、快速且雜質(zhì)干擾小，適合刺齒鳳尾蕨中5F的含量測定。

從含量測定結(jié)果可以看出，5F含量在刺齒鳳尾蕨的不同部位相差較大?？鼓[瘤活性成分5F主要集中在葉部位，莖中的含量較少，根中含量最低。因此，鑒于資源的合理利用原則，在開發(fā)利用刺齒鳳尾蕨作為抗腫瘤藥用植物資源時，只需利用其地上部分。

[1] 丁恒山.中國藥用孢子植物[M].上海：上海科學技術(shù)出版社，1982：408.

[2] 張 曉，崔 燎，田中信壽，等.半邊旗有效成分及抗腫瘤活性研究[J].中國藥學雜志，1997，32（1）：37.

[3] 吳科鋒，呂應年，劉 義，等.半邊旗提取物5F-Na鹽溶液的制備及體外抑癌作用研究[J].中國藥房，2010，21（47）：4419.

[4] Chen GG，Liang NC，Lee JF，et al.Over-expression of Bcl-2against Pteris semipinnata L.induced apoptosis of human colon cancer cells via a NF-kappa B-related pathway[J].Apoptosis，2004，9（5）：619.

[5] Liu Z，Ng EK，Liang NC，et al.Cell death induced by Pteris semipinnata L.is associated with p53and oxidant stress in gastric cancer cells[J].FEBS Lett，2005，579（6）：1477.

[6] 龔先玲，茍占平，梁念慈，等.鳳尾蕨屬6種藥用植物抗腫瘤有效部位篩選[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21（7）：1599.

[7] Murakami T，Tanaka N.Occurrence，structure and taxonomic implications of ferm constituents[M].New York：Wien Springer-Verlag，1988：285.

Content Determination of Antitumor Active Component 5F from Pteris dispar

Lü Ying-nian，GOU Zhan-ping（Guangdong Key Lab for Research and Development of Natural Drugs，Guangdong Medical College，Guangdong Zhanjiang 524023，China）
HOU Ying-qi（Criminal Investigation Teaching and Research Section，The Central Institute for Correctional Police，Hebei Baoding 073007，China）
FAN Shi-jin，GOU Zhan-ping（College of Pharmacy，Guangdong Medical College，Guangdong Dongguan 523808，China）

OBJECTIVE：To establish an method for content determination of antitumor active component 5F from Pteris dispar，and to determine the content of 5F in different parts.METHODS：HPLC method was adopted.The separation was performed on Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-1%acetic acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0mL·min－1.UV detection wavelength was set at 242nm，and the column temperature was maintained at 30℃.RESULTS：The linear range of 5F was 6～96μg·mL－1（r＝0.9981）.The average recoveries were 103.33%，100.84%and 100.39%，and RSDs were 5.86%，3.05%and 1.02%（n＝6）.The content of 5F in the leaves of P.dispar was the highest，followed by the steam and root.CONCLUSION：The methods is stable，rapid and less interference from impurity，and can be used for the content determination of 5F in P.dispar.

Pteris dispar；Antitumor component；Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid（5F）；Content determination

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2012）47-4472-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.47.21

Δ廣東省科技計劃項目（2009B030801336）；東莞市高等院?？蒲袡C構(gòu)科技計劃項目（2008108101050）

＊副研究員。研究方向：天然活性產(chǎn)物。電話：0759-2388405。E-mail：lyn7591@hotmail.com

#通訊作者：教授，博士。研究方向：中藥的品種品質(zhì)。電話：0769-22896599。E-mail：gdzpgou@gdmc.edu.cn

2012-01-09

2012-02-29）