王小艷，張璐璐，索有瑞*

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所;2青海伊納維康生物科技有限公司，西寧810001

麗江大黃中多羥基芪類成分的提取工藝研究

王小艷1，張璐璐2，索有瑞1*

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所;2青海伊納維康生物科技有限公司，西寧810001

本文采用正交實(shí)驗(yàn)，以Rhapontin和Desoxyrhaponticin的總含量為指標(biāo)，運(yùn)用HPLC含量分析測(cè)定法，研究了麗江大黃中多羥基芪類成分的提取工藝。結(jié)果表明:以料液比1∶12，提取溫度65℃，pH=7，濃度為90%乙醇回流提取2 h為最佳提取條件，在此條件下提取的多羥基芪類成分Rhapontin和Desoxyrhaponticin的總含量為104.98 mg/g。

麗江大黃;多羥基芪類成分;提取工藝;正交實(shí)驗(yàn)

麗江大黃(Rheum likiangense)又稱黑七或雪三七，為蓼科(Polygonum L.)大黃屬(Rheum L.)波葉組植物，生于海拔2500～4000 m的林緣山坡或灌叢溝谷，主要分布于西藏、四川及云南省，在青海省內(nèi)主要產(chǎn)于玉樹(shù)、治多、囊謙等地［1，2］。麗江大黃屬于非正品大黃［3］，但在我國(guó)民間常用于治療外傷出血或內(nèi)服治跌打損傷和痢疾，其藥理作用具有較大的開(kāi)發(fā)價(jià)值［4］。隨著正品大黃資源的逐漸匱乏，從非正品大黃中尋找新的藥源植物并開(kāi)辟大黃植物資源的新用途亦顯得非常必要。

文獻(xiàn)報(bào)道稱非正品大黃中主含有豐富的多羥基芪類成分，并且近年來(lái)不少研究證明多羥基芪類成分具有降血脂、擴(kuò)張毛細(xì)管改善微循環(huán)、抗腫瘤、抗菌、抑制過(guò)敏反應(yīng)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫防御系統(tǒng)等作用［5］，例如華北大黃及河套大黃中含有的豐富的Rhapontin和Desoxyrhaponticin等成分具有降血脂、降血糖活性［6，7］。本文以非正品大黃中的麗江大黃作為研究對(duì)象，以Rhapontin和Desoxyrhaponticin的總含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出了麗江大黃中多羥基芪類成分的最佳提取工藝并測(cè)定其含量，以期為麗江大黃資源的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)用麗江大黃(Rheum likiangense)全植株采自青海玉樹(shù)地區(qū)，并經(jīng)本研究所吳征蘭老師鑒定。取麗江大黃新鮮根部，自然干燥、粉碎、備用。

1.2 儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀(配有:四元泵、標(biāo)準(zhǔn)型自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、Agilent DAD檢測(cè)器); HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司);高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司);R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申順生物科技有限公司);JA1003電子天平(上海精科天平);回流裝置。

Rhapontin和Desoxyrhaponticin對(duì)照品均為中科院西北高原生物研究所自制，經(jīng)檢測(cè)純度均大于98%;乙醇、氫氧化鈉、鹽酸為分析純，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高效液相色譜條件

色譜柱:大連依力特(250 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫:25℃;流動(dòng)相:甲醇-乙腈-水梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):320 nm。此條件下對(duì)照品與樣品的HPLC色譜分離圖見(jiàn)圖1。

表1 洗脫程序Table 1 Elution program

圖1 對(duì)照品(A)和麗江大黃提取液(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and crude extract of R.likiangense(B) 1.Rhapontin(10.4 min);2.Desoxyrhaponticin(28.1 min)

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

著重以省、市兩級(jí)果樹(shù)方面的科研技術(shù)服務(wù)團(tuán)隊(duì)為支撐，區(qū)級(jí)農(nóng)技人員為栽培技術(shù)學(xué)習(xí)和傳播的載體，加大對(duì)鄉(xiāng)鎮(zhèn)級(jí)農(nóng)技人員、櫻桃種植企業(yè)、合作社技術(shù)員及農(nóng)戶關(guān)于建園、栽培、水肥管理、整形修剪、花果管理、采收以及病蟲(chóng)害等技術(shù)環(huán)節(jié)的培訓(xùn)力度，并積極宣傳櫻桃優(yōu)新品種及其生態(tài)高效栽培技術(shù)，提高各層次人員對(duì)櫻桃規(guī)范化種植的認(rèn)識(shí)，不斷提高櫻桃生產(chǎn)管理技術(shù)水平。

分別精密稱取 Rhapontin和 Desoxyrhaponticin對(duì)照品5.4 mg和5.3 mg，置于10 mL容量瓶中用50%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。以高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器分別精密進(jìn)樣2、4、6、8、10、12 μL對(duì)照品溶液進(jìn)行分析測(cè)定，以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣量X(μg)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Rhapontin:Y=2968.6X-2.1867(R2=0.9999)，線性范圍為1.018～6.108 μg;Desoxyrhaponticin:Y= 3762.2X+249.37(R2=0.9998)，線性范圍為1.04～5.20 μg。

1.3.3 樣品的提取

分別稱取麗江大黃粉末10 g置于圓底燒瓶中，按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件分別進(jìn)行水浴加熱回流提取，提取后過(guò)濾并定容于250 mL容量瓶中，再分別吸取上述提取液5 mL置于25 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，即為供試液。

1.3.4 供試液含量測(cè)定

分別吸取上述供試液，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，按照1.3.1項(xiàng)下的高效液相色譜條件進(jìn)樣10 μL進(jìn)行分析測(cè)定，以外標(biāo)法分別計(jì)算樣品中Rhapontin和Desoxyrhaponticin的含量，并以兩者含量的總和作為樣品中多羥基芪類成分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝正交實(shí)驗(yàn)

選取了乙醇濃度、pH值、料液比、溫度、提取時(shí)間等影響提取效果的五個(gè)因素進(jìn)行了L16(45)正交實(shí)驗(yàn)考察，因素水平見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

以正交實(shí)驗(yàn)各提取樣品中Rhapontin(R)和Desoxyrhaponticin(D)兩種多羥基芪類成分的總含量為考察指標(biāo)，對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，見(jiàn)表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析Table 3 Results of orthogonal test and data analysis

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各因素對(duì)麗江大黃中多羥基芪類成分的提取效果影響程度依次為:乙醇濃度＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度＞pH值。

從上述正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析表中可得出，麗江大黃中多羥基芪類成分的最優(yōu)提取工藝條件為: A4B3C4D3E2，即90%乙醇，pH=7，料液比1∶12，溫度65℃，提取時(shí)間2 h。由于該組合不在正交實(shí)驗(yàn)表內(nèi)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該最優(yōu)工藝條件下提取的多羥基芪類成分的總含量可達(dá)104.98 mg/g，此條件下得到的麗江大黃提取液的HPLC分離圖見(jiàn)圖1(B)。

3 討論

3.1 本文首次研究報(bào)道了青海玉樹(shù)地區(qū)野生麗江大黃中多羥基芪類成分Rhapontin和Desoxyrhaponticin的含量;同時(shí)建立了這兩種成分的HPLC定量分析方法;并以這兩種成分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究確定了麗江大黃中多羥基芪類成分的最優(yōu)提取工藝，為青海麗江大黃植物資源的深度開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

3.2 為了提高植物原料的利用率以做到物盡其用，本文還篩選確定了麗江大黃的藥用器官部位，分析測(cè)定結(jié)果表明:多羥基芪類成分在麗江大黃植物的根中含量最為豐富，而根皮中的含量是根中含量的81.8%，因此，如果以多羥基芪類成分作為麗江大黃(非正品大黃)的藥效指標(biāo)成分，那么根皮也可作為重要的藥用器官部位。這一點(diǎn)與大黃藥材的傳統(tǒng)加工炮制要求(去皮根入藥)并不相同。此外，葉柄中的含量約為根中含量的1.33%;葉片中的含量約為根中含量的0.61%;而在莖和種子中均未檢出。

3.3 中國(guó)的大黃屬植物約有45種，而《中國(guó)藥典》收載的大黃只有3種;雖然中國(guó)開(kāi)發(fā)利用大黃的歷史悠久，但其藥用范圍較為單一，多偏重于瀉下功效。因此，需要加強(qiáng)對(duì)大黃中眾多生理活性成分(例如多羥基芪類成分)的研究，以期擴(kuò)大大黃的藥用范圍，并從大黃屬的近緣植物中尋找到新的藥源植物，開(kāi)辟和豐富大黃資源的用途。

1 Editorial Committee of Flora of China of Chinese Academy of Sciense(中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)).Flora of China(25)(中國(guó)植物志第25卷).Beijing:Science Press，1998:180.

2 Editorial Committee of Flora of Qinghai of Northwest Plateau Institute of Biology of Chinese Academy of Sciense(中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所青海志編輯委員會(huì)).Flora of Qinghai(1)(青海植物志第1卷).Xining:Qinghai People’s Publishing House，1997:158.

3 Xie ZQ(謝宗強(qiáng)).Element concentrations in Rheum palmatum and R.likiangense plants and soil in Tibet plateau.Chin J Appl Ecol(應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào))，2000，11:903-906.

4 Xie ZQ(謝宗強(qiáng)).Studies on certain ecological characteristics of Rheum likiangense in Yushu，Qinghai.Acta Ecol Sin (生態(tài)學(xué)報(bào))，2000，20:815-819.

5 Liao ZY(廖志云)，Wu ZZ(吳祖澤).Advances in research on biological activities and structure effect relationship of polyhydrostilbenes.Bull Acad Mil Med Sci(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊)，2004，28:492-494.

6 Wang JJ(王娟娟)，Chen ZQ(陳志強(qiáng))，Wang SX(王順喜).Measurement of desoxyrhaponticin in Rheum franzenbachii by high performance liquid chromatography.Acta Agric Jiangxi(江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào))，2008，20(5):59-60.

7 Chen ZQ(陳志強(qiáng))，Zhang WY(張文懿)，Zhang XL(張學(xué)良).et al.Preparative separation of polyhydrostilbenes Rhapontin from Rhapontineum hotaoense C.Y.Cheng et C.T.Kao.by HPLC.Chin Tradit Patent Med(中成藥)，2004，26:932-933.

Extraction Process of Polyhydroxystilbenes from Rheum likiangense

WANG Xiao-yan1，ZHANG Lu-lu2，SUO You-rui1*1Northwest Plateau Institute of Biology，Chinese Academy of Science;2Qinghai Innovator Biotech Co.Ltd，Xining，810001

In this paper the extraction process of polyhydroxystilbenes from Rheum likiangense was investigated by orthogonal experiment with contents of Rhapontin and Desoxyrhaponticin as indexes.Their contents were determined by HPLC.The optimum conditions for extraction are as follows:the solid-liquid ratio 1∶12，the temperature 65℃，the ethanol content 90%，pH=7，and extraction time 2 h.Under the optimal extract conditions，the total contents of two polyhydroxystilbenes including Rhapontin and Desoxyrhaponticin were 104.98 mg/g.

Rheum likiangense;polyhydroxystilbenes;extraction process;orthogonal experiment

1001-6880(2012)08-1105-04

2011-09-14 接受日期:2011-12-23

中國(guó)科學(xué)院“知識(shí)創(chuàng)新工程領(lǐng)域前沿”項(xiàng)目

*通訊作者 Tel:86-971-6143857;E-mail:yrsuo@nwipb.cas.cn

R93

A