于瑞莉，郭本恒，*，張 灝，吳正鈞，王蔭榆

1江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫214122; 2光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200436

羅氏乳桿菌無細(xì)胞上清培養(yǎng)液移除膽固醇能力的研究

于瑞莉1，郭本恒1，2*，張 灝1，吳正鈞2，王蔭榆2

1江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫214122;2光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200436

本文探討了羅氏乳桿菌DSM122460無細(xì)胞上清培養(yǎng)液(Cell-Free Supernatant，CFS)移除膽固醇的能力。采用鄰苯二甲醛法測(cè)定DSM122460和對(duì)照菌株ST-III發(fā)酵過程中及其CFS對(duì)膽固醇的移除能力，并研究不同CFS濃度下的移除能力。并采用HPLC法測(cè)定CFS對(duì)照、熱處理組和pH7.0組的膽鹽水解酶活力，同時(shí)測(cè)定其移除膽固醇能力。結(jié)果顯示，DSM122460不僅在發(fā)酵過程中具有較高的移除膽固醇能力，其CFS也表現(xiàn)出較高的移除能力，CFS中含有除膽鹽水解酶以外的可移除膽固醇的蛋白類成分。這提示可能存在一種乳酸菌移除膽固醇的新機(jī)制。

羅氏乳桿菌;CFS;移除膽固醇;BSH;HPLC

人體血清中膽固醇含量過高容易引發(fā)高血壓，冠心病等心腦血管疾病。國(guó)內(nèi)外的研究表明，乳酸菌具有較強(qiáng)的移除膽固醇作用。雖然有大量研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在體內(nèi)外具有移除膽固醇的益生功能，但作用機(jī)理尚未定論，只是提出幾種假說:(1)以Gilliland［1］為代表的同化理論者認(rèn)為乳酸菌細(xì)胞直接吸收膽固醇的同化作用;(2)Klaver和Vander Meer認(rèn)為乳酸菌產(chǎn)生膽鹽水解酶(Bile salt hydrolyase， BSH)將結(jié)合膽鹽分解為游離膽鹽，在酸性(pH＜6.0)條件下游離膽鹽溶解度降低而與膽固醇發(fā)生共同沉淀作用［2］;(3)其他機(jī)理。

Taranto［3］認(rèn)為羅氏乳桿菌具有較強(qiáng)的移除膽固醇能力，并進(jìn)行了深入研究。Younghoon Kim［4］發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌的CFS有較好的移除膽固醇能力。本文從CFS的角度研究了羅氏乳桿菌移除膽固醇能力，發(fā)現(xiàn)它在無菌體參與和BSH失活的條件下仍有移除膽固醇的能力，這表明羅氏乳桿菌CFS中可能含有移除膽固醇的新有效成分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源、化學(xué)試劑與培養(yǎng)基

菌株來源:羅氏乳桿菌DSM122460(臺(tái)灣大學(xué)贈(zèng)送)和植物乳桿菌ST-III(光明乳業(yè)技術(shù)中心保藏)。菌株使用前按1%的接種量接種到MRS肉湯，在37℃培養(yǎng)12 h，傳代兩次進(jìn)行活化，實(shí)驗(yàn)菌株在實(shí)驗(yàn)過程中4℃冰箱保存。

鄰苯二甲醛、?；悄懰徕c購(gòu)自Sigma公司，膽固醇、卵磷脂等其他試劑為國(guó)產(chǎn)常規(guī)生化純和分析純?cè)噭?/p>

MRS培養(yǎng)基:購(gòu)自德國(guó)Merck公司。

MRS-THIO液體培養(yǎng)基:在MRS液體培養(yǎng)基中加入0.2%巰基乙酸鈉(THIO)。

膽固醇培養(yǎng)基:MRS-THIO培養(yǎng)基加入一定濃度的膽固醇源。

1.1.2 儀器設(shè)備

Avanti J30I高速冷凍離心機(jī):Beckman Coulter公司;EmusiFlxe-C3高壓細(xì)胞破碎儀:加拿大AVESTIN(奧威斯汀)公司;PHS-25型PH計(jì):奧立龍公司;CE7250型紫外分光光度計(jì):BIO-AQUARIUS公司;Waters 600高相液相色譜:美國(guó)Waters公司; JY92-III超聲波細(xì)胞粉碎機(jī):寧波新芝生物科技股份有限公司;Heidolph2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:德國(guó)Heidolph公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 卵磷脂-膽固醇膠束的制備

根據(jù)Razin［5］等提供的方法制備膽固醇膠束，膽固醇膠束作為膽固醇培養(yǎng)基中的膽固醇源。具體的方法如下:準(zhǔn)確稱取22 mg卵磷脂和10 mg膽固醇(卵磷脂和膽固醇摩爾比為1.0∶0.9)于具塞試管，加入CHCl3溶劑2 mL，超聲波振蕩溶解。N2流吹干溶劑，加入10 mL無菌水。試管放入冰浴，通N2條件下超聲波(130 W，20 kHz)處理15 min，停止5 min保持溫度平衡，循環(huán)三次;所得的溶液于4℃，38，000×g離心20 min，所得的上清液即為卵磷脂－膽固醇膠束溶液。經(jīng)0.45 μm膜過濾作為膽固醇源待用，4℃保存，2～3 d內(nèi)使用，作為膽固醇源用于以下的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 膽固醇的測(cè)定

按照改良鄰苯二甲醛法［6］測(cè)定膽固醇濃度:準(zhǔn)確吸取0.5 mL待測(cè)膽固醇溶液于具塞試管，加入1.5 mL 95%的乙醇溶液劇烈混勻，加入1 mL 50%的KOH溶液劇烈混勻，60℃水浴皂化10 min，不時(shí)振蕩試管。冷卻至室溫，加入2.5 mL正己烷劇烈混勻，加入1.5 mL無菌水劇烈混勻，靜置10 min分層。準(zhǔn)確吸取正己烷層1 mL于另一潔凈試管，60℃ N2流吹干溶劑，加入2 mL 0.01 mg/mL鄰苯二甲醛(冰醋酸)溶液劇烈混勻，室溫放置10 min，邊振蕩邊加入2 mL濃H2SO4充分混勻。冷卻至室溫，550 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線［7］計(jì)算出膽固醇的含量。

1.2.3 菌體發(fā)酵過程中對(duì)膽固醇的移除作用

將種子液1%接種于含0.2%牛磺膽酸鈉的膽固醇培養(yǎng)基中，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液經(jīng)12000 g，4℃，離心10 min得到上清液。未接種的含0.2%?；悄懰徕c的膽固醇培養(yǎng)基做陽(yáng)性對(duì)照，含0.2%牛磺膽酸鈉的MRS-THIO培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。按照方法1.2.2測(cè)定未接種培養(yǎng)基和上清液的膽固醇濃度，根據(jù)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出膽固醇含量，膽固醇移除率的計(jì)算公式為:

1.2.4 CFS移除膽固醇能力［4］

菌株DSM122460在MRS培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24 h后，12000 g，4℃ 離心10 min，收集上清液，0.45 μm膜過濾后即得到CFS，–80℃保存待用。發(fā)酵液離心后的菌體沉淀用pH7.0磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，用發(fā)酵液1/10體積的磷酸鹽緩沖液將菌體沉淀制成懸浮液，經(jīng)超高壓細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞裂解物，0.45 μm膜過濾后，–80℃保存?zhèn)溆谩⒛懝檀寄z束、THIO和?；悄懰徕c加入到CFS或細(xì)胞裂解物中，使其終濃度分別為100 μg/mL、0.2%(w/v)和0.2%(w/v)。然后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，保溫18 h，反應(yīng)前對(duì)照組置于–80℃冰箱暫存，鄰苯二甲醛法測(cè)反應(yīng)前后膽固醇濃度。CFS移除膽固醇能力通過反應(yīng)前后膽固醇的移除率體現(xiàn)。

為了研究CFS不同濃度的移除膽固醇能力，用新鮮MRS培養(yǎng)基將CFS稀釋為原有濃度的75%，50%，25%。

1.2.5 BSH對(duì)膽固醇移除作用的影響

BSH的活力通過HPLC法測(cè)定反應(yīng)液中?；悄懰徕c(Sodium taurocholate，TC)的減少量。

將充分恢復(fù)活力的供試菌株，按1%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h， 10000 g，4℃離心10 min，上清液經(jīng)過無菌過濾后，CFS分成A、B、C三份，測(cè)其pH值。其中，A先經(jīng)過90℃，15 min熱處理，然后A、B、C上清培養(yǎng)液液按照上清培養(yǎng)液∶甲醇=2∶1的比例緩慢加入預(yù)冷的甲醇，4℃放置1 h，10000 g，4℃離心10 min。A、B用2 mL NaAc-EDTA緩沖液(1 mM EDTA，50 mM醋酸鈉)溶解沉淀，緩沖液pH值和上清液pH相同，C用2 mL pH為7.0的緩沖液溶解，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)其蛋白濃度。

酶反應(yīng):將A、B、C配成蛋白濃度相同的粗酶液，取粗酶液500 μL加入到含有0.04 mol/L牛黃膽酸鈉的螺口管中，37℃水浴30 min，反應(yīng)結(jié)束后加入500 μL流動(dòng)相終止反應(yīng)，緩沖液做空白對(duì)照。

HPLC色譜條件:Waters Delta 600 HPLC系統(tǒng)，高壓二元泵、PDA檢測(cè)器、在線脫氣機(jī);Nova-PakC18 (4 μm，3.9 mm×150 mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm，進(jìn)樣量為 15 μL。峰面積計(jì)算用 Millennium SoftwareV3.2，?；悄懰岬牧魉?.0 mL/min，所用有機(jī)溶劑均為色譜純。

流動(dòng)相A:1000 mL甲醇和1.2 mL冰乙酸混合用5 mol/L的NaOH調(diào)其pH值為5.6，流動(dòng)相B: 1000 mL去離子水和1.2 mL冰乙酸混合用5 mol/L的NaOH調(diào)其pH值為5.6，通過0.45 μm聚丙烯過濾器抽濾。

1.2.6 CFS中有效成分的初步鑒定

為了探究CFS中發(fā)揮移除膽固醇作用的物質(zhì)，通過乙醇抽提多糖，乙酸乙酯萃取脂類和硫酸銨沉淀蛋白的辦法進(jìn)行初步鑒定。在此基礎(chǔ)上，用12%三氯乙酸和0.5%十二烷基硫酸鈉(dodecyl sulfate，sodium salt，SDS)處理CFS進(jìn)一步研究有效成分的性質(zhì)。

乙醇抽提多糖方法如下:向CFS中加入95%乙醇，使其終體積為75%，4℃靜置過夜，9000 rpm離心10 min，棄去上清，蒸餾水溶解沉淀，置于–20℃保存待用。

乙酸乙酯抽提步驟:按照CFS與乙酸乙酯為3: 1的關(guān)系向CFS中加入乙酸乙酯，倒入分液漏斗中，充分混勻，靜置待分層，萃取三次。收集上層液體，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉乙酸乙酯后，蒸餾水溶解剩余物質(zhì)，置于–20℃保存待用。

向CFS中加入硫酸銨使其飽和度為60%，4℃靜置過夜后，12000 g離心10 min，沉淀用蒸餾水溶解后4℃透析兩天。

CFS中加入三氯乙酸和 SDS使其終含量為12%和0.5%，4℃靜置12 h，離心，棄去沉淀，上清液4℃透析兩天。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

文中數(shù)據(jù)為三次平行測(cè)定值的平均值，經(jīng)oneway ANOVA分析，以±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Origin軟件(Origin 7.5，美國(guó)Origin Lab公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果

2.1 菌體發(fā)酵過程、CFS和細(xì)胞裂解物移除膽固醇能力的比較

羅氏乳桿菌和植物乳桿菌都是目前具有較高移除膽固醇能力的乳酸菌。其中ST-III的移除膽固醇的機(jī)理認(rèn)為主要是同化作用和沉淀作用共同起作用，同化作用占主要作用［8］。如圖1所示，同樣在菌體發(fā)酵過程中具有較高降低膽固醇能力的乳酸菌，ST-III只在發(fā)酵過程時(shí)表現(xiàn)出較高的膽固醇移除能力，移除率為67.6%，其CFS移除膽固醇能力相對(duì)較弱，只有9.14%。而DSM122460除了在菌體發(fā)酵過程中具有很高的膽固醇移除能力，在無細(xì)胞存在時(shí)的CFS中也有較高的膽固醇移除能力，移除率為68.57%。另外，對(duì)DSM122460和ST-III進(jìn)行細(xì)胞破碎后得到的細(xì)胞裂解物按照方法1.2.4測(cè)定移除膽固醇能力，發(fā)現(xiàn)兩者的細(xì)胞裂解物基本上不表現(xiàn)移除膽固醇的能力。

圖1 L.reuteri DSM122460和L.plantarum ST-III的生長(zhǎng)細(xì)胞、CFS和細(xì)胞裂解物在含有0.2%的?；悄懰徕c的膽固醇培養(yǎng)基中移除膽固醇能力比較Fig.1 Cholesterol removal by Growth(black bars)，the Cell-Free Supernatant(CFS，grey bars)and cell extract(pattern bars)in an MRS-THIO Broth Supplemented with 0.2%Sodium Taurocholate，plus cholesterol Micells of L.reuteri DSM122460 and L.plantarum ST-Ⅲ

用新鮮MRS液體培養(yǎng)基對(duì)CFS進(jìn)行梯度稀釋，按照方法2.1.4保溫。結(jié)果顯示CFS的膽固醇移除能力隨著濃度的減少而降低，如圖1所示。

圖2 L.reuteri DSM122460不同濃度CFS對(duì)移除膽固醇能力的影響Fig.2 The effects on Cholesterol Removal by CFS of L.reuteri DSM122460 at different concentrations

2.2 BSH對(duì)移除膽固醇能力的影響

自從發(fā)現(xiàn)乳酸菌在腸道中可使結(jié)合膽鹽分解為游離膽鹽以來，BSH被認(rèn)為在乳酸菌移除膽固醇方面起著關(guān)鍵作用。BSH將結(jié)合膽鹽水解為游離膽鹽后，游離膽鹽需要在酸性條件下(pH＜6.0)才能和膽固醇發(fā)生共沉淀作用，從而起到移除膽固醇的能力。M.P.Taranto［4］報(bào)道羅氏乳桿菌BSH為胞內(nèi)酶，相對(duì)分子量為80 KDa，最適pH為5.2，最適溫度為42℃。本文為了研究BSH對(duì)羅氏乳桿菌的CFS移除膽固醇能力的影響，將CFS經(jīng)過加熱處理(90℃、15 min)和調(diào)節(jié)體系pH值(pH7.0)，再觀察其移除膽固醇能力的變化，從而推斷BSH對(duì)Lb.reuteri DSM122460 CFS移除膽固醇能力的影響。

DSM122460發(fā)酵后CFS的pH值為4.4，CFS經(jīng)過甲醇沉淀提取粗酶液，粗酶液經(jīng)緩沖液溶解與TC反應(yīng)后用HPLC分析殘余TC的含量，結(jié)果如表1所示，TC標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間在6.7 min左右出峰，樣品組中6.7 min左右出的峰是TC組分。

表1 ?；悄懰徕c含量檢測(cè)結(jié)果Table 1 The result of the detected sodium taurocholate

圖3 經(jīng)過熱處理、pH處理和未處理CFS的BSH活力和移除膽固醇能力比較Fig.3 Effects of Heat，pH Treatment and CFS control on the Cholesterol Reduction(black bars)and BSH Activities (grey bars)of a Cell-Free Supernatant(CFS)

CFS對(duì)照組和經(jīng)過處理的CFS其BSH活力和移除膽固醇能力的比較如圖3所示，CFS對(duì)照組同時(shí)具有較強(qiáng)移除膽固醇能力和強(qiáng)度相當(dāng)?shù)腂SH活力。將pH調(diào)為7.0后，CFS具有較低的BSH活力，此時(shí)雖然還有BSH活性，但是因?yàn)橹挥性谒嵝詶l件下，游離膽鹽才能和膽固醇共同沉淀下來，理論上來講pH7.0時(shí)通過共沉淀作用移除膽固醇的能力應(yīng)該比較低，但是圖3中顯示pH7.0時(shí)移除膽固醇的能力仍能保持在CFS對(duì)照組的70%左右;而經(jīng)過熱處理(90℃、15 min)的CFS盡管殘留了較低BSH活力，但其膽固醇移除能力幾乎喪失殆盡。

2.3 CFS有效成分的初步鑒定

CFS乙醇抽提物有20%的移除膽固醇能力，乙酸乙酯萃取物只有百分之幾的移除能力，硫酸銨沉淀后有45%的移除能力。另外，CFS經(jīng)過12%三氯乙酸或0.5%SDS除去蛋白后，基本上沒有移除膽固醇能力。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從CFS的角度研究羅氏乳桿菌移除膽固醇的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)羅氏乳桿菌DSM122460和植物乳桿菌ST-III在發(fā)酵過程都具有較好的移除膽固醇能力，但是就對(duì)CFS而言，羅氏乳桿菌DSM122460的移除膽固醇能力要明顯強(qiáng)于ST-III，可達(dá)到68.57%左右。進(jìn)一步對(duì)CFS進(jìn)行梯度稀釋后，結(jié)果表明CFS的移除膽固醇能力隨濃度的降低而降低，證明CFS中含有可移除膽固醇的有效成分。

但是羅氏乳桿菌中的BSH在體外移除膽固醇的過程中起著非常重要的作用，所以必須排除CFS中BSH的影響。經(jīng)過熱處理可使BSH失去活力，將CFS調(diào)pH為7.0時(shí)由其起作用的游離膽酸和膽固醇的沉淀作用不容易發(fā)生，也可以排除BSH的影響。結(jié)果顯示經(jīng)過熱處理的CFS具有較低的BSH活性和移除膽固醇能力，pH為7.0的CFS在具有較低BSH活性的情況下仍然具有較高的移除膽固醇能力，可以表明CFS中除了BSH以外還有可以移除膽固醇的有效成分。CFS經(jīng)過鹽析后的蛋白沉淀有較高的移除膽固醇能力，但經(jīng)過SDS和三氯乙酸除蛋白后，基本沒有移除膽固醇的能力，既可證明CFS中此有效成分為蛋白質(zhì)類。

后續(xù)工作將致力于研究此有效成分的分離，進(jìn)一步純化并提取出該物質(zhì)，并分析其移除膽固醇的作用機(jī)理。

1 Gilliland SE，Nelson CR，Maxwell C.Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus.Appl Environ Microbiol，1985，49:377-381.

2 Klaver FR，Vander Meer R.The assumed assimilation of cholesterol by Lactobacilli and Bifidbacterium bifidum is due to their bile salt deconjugating activity.Appl Environ Microbiol，1993，59:1120-1124.

3 Taranto MP，Sesma F，De Valdez GF.Bile salt hydrolase plays a key role on cholesterol removal by Lactobacillus reuteri.Biotechnol Lett，1997，19:845-847.

4 Kim Y，Whang JY，Whang KY，et al.Characterization of the cholesterol-reducing activity in a cell-free supernatant of Lactobacillus acidophilus ATCC 43121.Biosci Biotechnol Biochem，2008，72:1483-1490.

5 Razin S，Kutner S，Efrati H，et al.Phospholipid and cholesterol uptake by mycoplasma cells and membranes.Biochim Biophys Acta，1980，598:628-640.

6 Rudel LL，Morris MD.Determination of cholesterol using οphthalaldehyde.J Lipid Res，1973，14:364-366.

7 Gilliland SE，Walker DK.Factors to consider when selecting a culture of lactobacillus acidophilus as a dietary adjunct to produce a hypocholesterolemic effect in humans.J Dairy Sci，1990，3:905-911.

8 Liu J(劉娟)，Wang YY(王蔭榆)，Wu ZJ(吳正鈞)，et al.Study on mechanism of cholesterol removal by Lactobacillus plantarum ST-III Strain.Ind Microbiol(工業(yè)微生物)，2008，38(5):71-91.

Cholesterol-Reducing Activity in a Cell-Free Supernatant of Lactobacillus reuteri

YU Rui-li1，GUO Ben-heng1，2*，ZHANG Hao1，WU Zheng-jun2，WANG Yin-yu21State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China; 2State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Technology Center of Bright Dairy and Food Co.Ltd.，shanghai 200436，China

The cholesterol removal ability of cell-free supernatant(CFS)produced by growth of Lactobacillus reuteri DSM122460 in MRS broth was investigated.The cholesterol removal ability of L.reuteri train DSM122460 as well as L.plantarum strain ST-III during growth in MRS and the resulted CFS was assayed by o-phthalaldehyde method，respectively.In order to elucite the correlation between BSH activity and the cholesterol removal ability of the Lactobacillus strains，BSH roles in cholesterol removal were measured by heat treatment and pH adjustment.The remaining BSH activities after various treatments were measured by HPLC.The results showed that L.reuteri strain DSM122460 not only had a high ability to remove cholesterol during its growth in MRS broth，it aslo demonstrated high cholesterol reduction activity in the CFS.Beside the BSH，it was speculated there may be another effective component in the CFS with the ability to remove cholesterol.It suggested that there might be a new mechanism underlying cholesterol reduction by lactic acid bacteria.

Lactobacillus reuteri;CFS;cholesterol reduction;BSH;HPLC

1001-6880(2012)01-0089-05

2010-09-28 接受日期:2011-02-28

上海市科技委員會(huì)乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心(09DZ2251400);上海市科技委員會(huì)乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室籌建(10dz2221100)

*通訊作者 E-mail:guobenheng@brightdairy.com

TS201.3

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