徐 敏 (荊州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，湖北 荊州 434020)

溶菌酶提取試驗(yàn)的適宜條件探討

徐 敏 (荊州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，湖北 荊州 434020)

利用離子交換樹脂吸附法可以從雞蛋清中提取溶菌酶。針對該試驗(yàn)方法的適宜條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，溶菌酶提取試驗(yàn)的適宜條件為：D152陽離子交換樹脂中氫型樹脂和鈉型樹脂為1∶1；每100ml蛋清中樹脂液為25ml；吸附時間為6h；洗滌次數(shù)為3～4次；洗脫液濃度為10%；鹽析濃度為32%。

陽離子交換樹脂;溶菌酶；吸光度

溶菌酶是一種有效的抗菌劑，又稱胞壁質(zhì)酶或N-酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，廣泛存在于動物、植物及微生物體中。雞蛋和哺乳動物的乳汁是溶菌酶的主要來源，其中以雞蛋清中含量較高。由于離子交換樹脂吸附法的操作過程簡單且易于完成，因而一般采用該方法從雞蛋清中提取溶菌酶，其中蛋白質(zhì)含量(包括酶吸附量和雜蛋白含量)通過測定其吸光度值來確定。下面，筆者對溶菌酶提取試驗(yàn)的適宜條件進(jìn)行探討。

1 試驗(yàn)部分

1.1試驗(yàn)材料和儀器

1)試驗(yàn)材料 新鮮雞蛋；D152陽離子交換樹脂(荊州化工廠)；溶壁微溶壁微球菌(荊州微生物研究所)；硫酸銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸鈉、丙酮等試劑(皆為國產(chǎn)分析純)。

2)試驗(yàn)儀器 78-1磁力攪拌計(jì)(荊州儀表電機(jī)廠)；722型可見光柵分光光度計(jì)(沙市光學(xué)儀器廠)；GSY-2恒溫水浴鍋(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)；2XZ-1旋片式真空泵(臨海市精工真空設(shè)備廠)；DZF-250小型真空干燥器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2試驗(yàn)方法

1)蛋清的制備 將雞蛋用20℃的蒸餾水洗凈，在雞蛋兩端各敲一個小洞，使蛋清流出，攪拌2min使蛋清均勻(以不產(chǎn)生泡沫為宜)[1]，用4層紗布過濾后得到蛋清液。

2)吸附 將蛋清液放置冰箱中降溫到5℃后，加入D152陽離子交換樹脂并攪拌7h后靜置。

3)洗脫 將上層清液傾出，下層樹脂用等體積的去離子水清洗以除去吸附的蛋白質(zhì)，然后過濾并重復(fù)清洗，再將樹脂抽濾除去水分。把清洗好的樹脂倒入到與樹脂體積相等的硫酸銨溶液中進(jìn)行洗脫，攪拌約半小時后，進(jìn)行過濾，如此重復(fù)2次。

4)鹽析 過濾抽干后，合并洗脫液，緩慢加入硫酸銨溶液，然后將混合物放入冰箱中靜置，再離心過濾，將濾餅預(yù)冷到-10℃后用丙酮洗滌，離心分離后放入真空干燥箱，在35℃條件下干燥3h后即得到溶菌酶粗品。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1氫型和鈉型樹脂的比例

D152陽離子交換樹脂包括氫型樹脂和鈉型樹脂，2種樹脂對蛋清pH的影響不同并導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生差異[2]。D152陽離子交換樹脂中氫型樹脂和鈉型樹脂溶菌酶吸附量如下表1所示。

表1 D152陽離子交換樹脂中氫型與鈉型樹脂的比例和溶菌酶吸附量的關(guān)系

由表1可以看出，當(dāng)氫型樹脂與鈉型樹脂的比例為1∶1時溶菌酶吸附量最大，因而確定D152陽離子交換樹脂中氫型樹脂和鈉型樹脂為1∶1。

2.2樹脂用量

當(dāng)樹脂的用量不同時，測定樹脂洗脫液吸光度,結(jié)果如表2所示(表中樹脂用量以每100ml蛋清中含樹脂液的體積表示)。

由表2可知，當(dāng)每100ml蛋清中含樹脂液的體積達(dá)到25ml后，溶液的吸光度不再增加，說明蛋清中已沒有溶菌酶。考慮到經(jīng)濟(jì)適用性，試驗(yàn)中樹脂用量以每100ml蛋清中含樹脂液的體積為25ml為宜。

2.3吸附時間

蛋清的粘度較大，需以一定速度進(jìn)行攪拌，這樣有利于溶菌酶的吸附。在相同攪拌速度下，測定不同吸附時間的樹脂洗脫液吸光度，結(jié)果表3所示。

表2 樹脂用量和溶菌酶吸附量的關(guān)系

表3 吸附時間對溶菌酶吸附量的影響

由表3可知，當(dāng)吸附時間小于6h時，隨著吸附時間的增加，吸光度值增加，說明溶菌酶的吸附量增加；當(dāng)吸附時間大于6h后，隨著吸附時間的增加，吸光度值有所減小，說明溶菌酶的吸附量下降。因此，吸附時間以6h為宜。

2.3洗滌次數(shù)

表4 洗滌次數(shù)與雜蛋白含量的關(guān)系

進(jìn)行離子交換樹脂吸附試驗(yàn)時，離子交換劑除與蛋清中溶菌酶發(fā)生離子交換作用外，可能還會吸附某些雜蛋白，因而在洗脫前，將上層清液傾出后，對下層樹脂需用去離子水清洗以除去雜蛋白。試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

由表4可知，隨著洗滌次數(shù)增加，溶液里雜蛋白含量逐漸減少，當(dāng)洗滌次數(shù)超過3次后溶液中雜蛋白含量很低。因此，確定洗滌次數(shù)為3～4次。

2.4洗脫液濃度

試驗(yàn)中采用一定濃度的硫酸銨溶液洗脫樹脂上的溶菌酶，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)硫酸銨溶液濃度達(dá)到10%后，樹脂洗脫液的吸光度不再發(fā)生變化，說明樹脂上的溶菌酶基本上被洗脫，考慮到經(jīng)濟(jì)適用的原則，確定洗脫液濃度為10%。

2.5鹽析濃度

鹽析時，當(dāng)加入不同濃度硫酸銨時，其溶液的吸光度變化如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)硫酸銨濃度為32%時吸光度最小，說明其溶液中溶菌酶吸附量最低。因此，確定鹽析濃度為32%。

3 結(jié) 語

離子交換樹脂吸附法提取雞蛋清中溶菌酶的程序簡潔，操作簡單易于完成。針對該方法的適宜試驗(yàn)條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，溶菌酶提取試驗(yàn)的適宜條件為：D152陽離子交換樹脂中氫型樹脂和鈉型樹脂為1∶1；每100ml蛋清中樹脂液為25ml；吸附時間為6h；洗滌次數(shù)為3～4次；洗脫液濃度為10%；鹽析濃度為32%。

圖1 洗脫液濃度對溶菌酶吸附量的影響 圖2 硫酸銨濃度對溶菌酶吸附量的影響

[1]李建武.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M].北京:北京大學(xué)出版社,1994.

[2]張珍田,陳良惠,宋賢一,等.利用超過濾法純化雞蛋白溶菌酶之研究[J].中國農(nóng)業(yè)化學(xué)會志,1997,16(2):58-59.

10.3969/j.issn.1673-1409(N).2012.08.007

TQ464.8

A

1673-1409(2012)08-N019-02

2012-05-24

徐敏(1968-)，女， 1987年大學(xué)畢業(yè)，講師，現(xiàn)主要從事生物化學(xué)方面的教學(xué)與研究工作。

[編輯] 李啟棟