張湘東 宋偉峰 鐘 鳴 羅淑媛

1.中藥提取分離過(guò)程現(xiàn)代化國(guó)家工程研究中心 廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開(kāi)發(fā)有限公司，廣東廣州 510240；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東廣州 510630

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定山銀花水提取液的化學(xué)成分

張湘東1宋偉峰2鐘 鳴1羅淑媛2

1.中藥提取分離過(guò)程現(xiàn)代化國(guó)家工程研究中心 廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開(kāi)發(fā)有限公司，廣東廣州 510240；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東廣州 510630

目的建立快速、準(zhǔn)確分析山銀花水提取液的化學(xué)成分的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法。 方法采用水為溶劑加熱回流提取法提取山銀花藥材，提取液采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)其主要的化學(xué)成分進(jìn)行分離和鑒定。 結(jié)果在負(fù)離子模式下，21個(gè)主要的化學(xué)成分得到了較好的分離，其中16個(gè)通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，10個(gè)通過(guò)對(duì)照品得到了確證。 結(jié)論 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法可有效用于山銀花藥材的化學(xué)成分的分析鑒定。

山銀花；水提取液；化學(xué)成分；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

山銀花（Lonicerae Flos）為忍冬科植物灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）、紅 腺忍 冬 （Lonicera hypoglauca Miq.）、華南忍冬（Lonicera confusa DC.）或黃褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa Hsuet et S.C.Cheng）的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花[1]，并為《中國(guó)藥典》2010年版收載，為《中國(guó)藥典》2010年版金銀花項(xiàng)下分離出來(lái)的新增品種[2]。山銀花作為常用中藥，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功效，臨床用于治療癰腫疔瘡、喉痹、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫?zé)岚l(fā)病等[3]。近年來(lái)對(duì)其化學(xué)成分的研究表明，其主要活性成分為有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)和三萜皂苷等[4-6]。隨著質(zhì)譜技術(shù)的革新和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的普遍應(yīng)用，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越多地應(yīng)用于中藥分析。與高效液相-紫外檢測(cè)（HPLC-UV）比較，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MSn）具有很高的靈敏度和選擇性，并且能夠提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，在中藥化學(xué)成分分析鑒定中具有很大的優(yōu)勢(shì)。由于中藥飲片主要采用水煎煮的方式服用，研究其水提取液的化學(xué)成分意義重大。本文采用水為溶劑加熱回流提取山銀花的活性成分，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MSn）分析山銀花水提液，為山銀花藥材的合理開(kāi)發(fā)利用以及其質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

LCQ Fleet HPLC-MSn高效液相色譜離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó) Thermo Fisher公司）；Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher公司）；色譜柱：Hypurity C18高效液相色譜柱（150 mm × 2.1 mm，5 μm，美國(guó) Thermo Fisher公司）。 乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher Scientific公司），其他試劑為分析純，水為二次蒸餾水。山銀花藥材購(gòu)自廣州采芝林藥店，經(jīng)制藥高級(jí)工程師鐘鳴鑒定為灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品提取

取山銀花藥材粉碎，稱取10 g置圓底燒瓶中，加100 mL水，加熱回流提取2 h，提取液冷卻后轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中，定容后過(guò)0.45 μm濾膜，待分析。

表1 山銀花水提取液的化學(xué)成分分析

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 Hypurity C18高效液相色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流動(dòng)相 A 為 0.5%甲酸，B 為乙腈，梯度洗脫：0～5 min，98%A，2%B；6～30 min，2%～12%B；31～60 min，12%～28%B；61～80 min，28%～95%B；后運(yùn)行 10 min，98%A，2%B。 流速為 0.3 mL/min，進(jìn)樣量為 5.0 μL，柱溫為 25℃。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧（ESI）離子源，負(fù)離子檢測(cè)模式；噴霧電壓為 4.0 kV；鞘氣（N2）流速：80 個(gè)運(yùn)移單位；輔助氣（N2）流速：15個(gè)運(yùn)移單位；碰撞氣體：氦氣；毛細(xì)管溫度：350℃。質(zhì)譜掃描范圍為m/z 50～1 000，MSn碰撞能量為40%。

2.3 成分分析

山銀花藥材水提取液的HPLC-MS分析總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，色譜圖上有21個(gè)明顯的色譜峰，通過(guò)與相關(guān)文獻(xiàn)[7]比較每個(gè)色譜峰一級(jí)質(zhì)譜信息、二級(jí)質(zhì)譜信息以及C18色譜柱的洗脫順序，其中的16個(gè)化合物得到了推測(cè)鑒定，這些化合物的保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜、多級(jí)質(zhì)譜和分子式見(jiàn)表1。再通過(guò)與對(duì)照品比較保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜和多級(jí)質(zhì)譜信息，化合物 1、2、3、4、5、10、11、12、13 和 15 分別確證為奎寧酸、檸檬酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸A、異綠原酸B、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙?；衔?、7、8、14和16通過(guò)與相關(guān)文獻(xiàn)比較推測(cè)為3-O-咖啡奎寧酸甲酯、斷氧化馬錢(qián)子苷、異槲皮苷、灰氈毛忍冬皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷甲[7]?；衔?與化合物10、11、12具有相同的一級(jí)質(zhì)譜信息，它們的多級(jí)質(zhì)譜碎片信息也非常相似，提示它們具有相似的結(jié)構(gòu)，因此推測(cè)鑒定為異綠原酸異構(gòu)體。色譜圖上的其他色譜峰由于缺乏相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道和對(duì)照品，結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步分析鑒定。

山銀花中的咖啡奎寧酸類(lèi)化合物的多級(jí)質(zhì)譜裂解途徑主要是咖啡?；涂鼘幩徇B接的斷裂，而黃酮苷和三萜皂苷類(lèi)化合物的裂解規(guī)律主要是糖鏈的斷裂，得到失去一個(gè)或多個(gè)分子糖的碎片信息，并且在多級(jí)質(zhì)譜中能觀察到苷元的碎片離子信息。

3 討論

圖1 山銀花水提取液的總離子流圖

山銀花作為常用中藥，資源極為豐富，同時(shí)也是多種制劑的原藥材。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)山銀花水提取液進(jìn)行了HPLCMSn分析，研究了其水溶性的化學(xué)成分。根據(jù)各個(gè)色譜峰在質(zhì)譜圖中對(duì)應(yīng)的準(zhǔn)分子離子峰信息、碎片信息、質(zhì)譜裂解規(guī)律和色譜保留規(guī)律，并參考相關(guān)文獻(xiàn)，成功鑒定了16個(gè)化合物，并推測(cè)了化合物的質(zhì)譜裂解機(jī)制。實(shí)驗(yàn)表明，HPLC-MSn技術(shù)能有效分析山銀花中的有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)和三萜皂苷類(lèi)成分。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，綠原酸和異綠原酸等有機(jī)酸類(lèi)成分具有顯著的抗病毒、調(diào)節(jié)糖脂代謝等作用[8-9]，異槲皮苷等黃酮類(lèi)成分具有良好的抗炎活性，灰氈毛忍冬皂苷和川續(xù)斷皂苷等三萜皂苷具有抗腫瘤活性[10]。該三大類(lèi)成分都具有非常良好的藥理活性，并且可通過(guò)水提的方式提取，而中藥飲片主要采用水煎煮的方式服用，因此，這三類(lèi)物質(zhì)共同構(gòu)成了山銀花的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)為山銀花藥材的水溶性化學(xué)成分研究、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、藥理藥效作用研究和藥材的合理開(kāi)發(fā)利用提供了準(zhǔn)確有效的理論依據(jù)。

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Identification of the major components from the water extract of Lonicerae Flos by high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

ZHANG Xiangdong1SONG Weifeng2ZHONG Ming1LUO Shuyuan2
1.National Engineering Research Center for Modernization of Extraction and Separation Process of TCM Guangzhou Hanfang Modern Medicine Research&Development Co.Ltd,Guangdong Province,Guangzhou 510240,China;2.The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangdong Province,Guangzhou 510630,China

ObjectiveTo establish a high-performance liquid chromatogranphy coupled with tandem mass spectrometry(HPLC-MSn)method for analyzing the chemical constituents from the water extract of Lonicerae Flos rapidly and accurately.MethodsLonicerae Flos was extracted by reflux extraction using water as solvent,and the extract was separated and identified by HPLC-MSn.ResultsUnder the negative-ion mode,21 major constituents were well separated,16 of them were identified by tandem mass spectrometer and 10 of them were confirmed by a comparison.ConclusionThe HPLCMSn method is useful for the rapid identification of the chemical constituents from Lonicerae Flos.

Lonicerae Flos;Water extract;Components;High-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

R927.2

A

1673-7210（2012）08（c）-0113-03

2011年國(guó)家工程研究中心創(chuàng)新能力建設(shè)項(xiàng)目。

張湘東（1971.5-），男，碩士研究生，制藥工程師，主要從事中藥/天然藥物的研究與開(kāi)發(fā)工作。

鐘鳴（1973.2-），男，碩士研究生，制藥高級(jí)工程師，主要從事中藥/天然藥物的研究與開(kāi)發(fā)工作。

2012-06-19 本文編輯：衛(wèi) 軻）