楊玉蘭，姜文俠，劉琦，孫瑞雪

1(天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過(guò)程工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津，300308)2(天津科技大學(xué)，天津，300457)

氨肽酶(aminopeptidase)是蛋白水解酶中外肽酶的一類(lèi)，它們能從蛋白質(zhì)和多肽鏈的N末端順序水解氨基酸，其催化機(jī)理可以用下式表示:

甲硫氨酸氨肽酶是氨肽酶中的一種，在蛋白質(zhì)加工過(guò)程中負(fù)責(zé)切除新生肽鏈N端的起始甲硫氨酸，對(duì)細(xì)胞的成熟，生長(zhǎng)和防御都具有重要的作用，維持著細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡［1］，此外還作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、特異性位點(diǎn)的重組因子和毒素受體參與抗生素的活化與轉(zhuǎn)運(yùn)［2］。甲硫氨酸氨肽酶特有的水解方式和功能，決定了其廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、發(fā)酵、飼料及生物技術(shù)等行業(yè)［3－6］。目前氨肽酶制劑主要應(yīng)用于功能肽的制備和蛋白質(zhì)水解食品的生產(chǎn)加工過(guò)程，用以提高營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量，改善產(chǎn)品的最終風(fēng)味。由于氨肽酶能促進(jìn)不良口感疏水肽的水解、釋放其他具有愉快口感的肽和自由氨基酸［7］，氨肽酶已經(jīng)成為水解蛋白脫苦制劑的首選。

菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)氨肽酶的物質(zhì)基礎(chǔ)，從自然界篩選并在實(shí)驗(yàn)室誘變進(jìn)化一直是發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新工業(yè)微生物菌種的重要手段。常規(guī)的菌種選育方法工作量大、周期長(zhǎng)、效率低、成本高［8］。采用高通量方法篩選新型的氨肽酶和氨肽酶高產(chǎn)菌株，既可提高工作效率，降低成本，又能大幅度地提高篩選速度［9－10］。但高通量篩選氨肽酶產(chǎn)生菌關(guān)鍵程序中酶活測(cè)定的工作量非常大，消耗的試劑也很多，特別是用于酶活測(cè)定的底物價(jià)格昂貴。為了使測(cè)定方法更加方便迅速，降低消耗，以適應(yīng)微量化發(fā)酵培養(yǎng)的酶活測(cè)定，實(shí)現(xiàn)真正意義上的高通量篩選，本文在對(duì)硝基苯胺法的基礎(chǔ)上，對(duì)3種不同來(lái)源的甲硫氨酸氨肽酶進(jìn)行檢測(cè)條件的優(yōu)化，建立適應(yīng)高通量篩選的微量化檢測(cè)方法——酶標(biāo)板法，并與常規(guī)的對(duì)硝基苯胺法進(jìn)行比較以驗(yàn)證該方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

甲硫氨酸氨肽酶產(chǎn)生菌11-11-16-2-5AL、11-10-18-7-AL和12-3-16-14AL，為本實(shí)驗(yàn)室分別從麥醬、臭豆腐和腐乳中分離。

種子培養(yǎng)基(g/L):麥芽糊精8，酵母粉2，蛋白胨8，KH2PO41，MgSO40.2，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):麥芽糊精15，酵母粉10，蛋白胨5，牛肉膏2，KH2PO42.7，MgSO40.1，NaCl 1，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 主要試劑和儀器

甲硫氨酸對(duì)硝基苯胺(sigma公司，分析純)，對(duì)硝基苯胺(sigma公司，分析純)，其它均為市售分析純。

全功能微孔板檢測(cè)儀(Bio-Tek)，紫外分光光度計(jì)(普析通用 TU-1810PC型)，酶標(biāo)板(Greinerbio-one)，8道自動(dòng)移液器(BRAND)，臥式恒溫振蕩器(精騏 IS-RDH1型)，電熱恒溫水浴鍋(泰斯特);高速冷凍離心機(jī)(Hettich)，48孔深孔板(上海甘薇)。

1.3 溶液

氨－氯化銨緩沖液(40 mmol/L):稱(chēng)取1.07 g NH4Cl溶于90 mL蒸餾水中，以5%的氨水調(diào)pH至8.0，定容至100 mL。

底物溶液(6 mmol/L):稱(chēng)取0.016 g甲硫氨酸對(duì)硝基苯胺，于10 mL蒸餾水中50℃水浴至完全溶解，定容至10 mL。

終止液:50%的乙酸水溶液。

對(duì)硝基苯胺溶液:準(zhǔn)確稱(chēng)取對(duì)硝基苯胺，以蒸餾水配制400 μmol/L溶液，然后將其依次稀釋至150、200、250、300 μmol/L 和 350 μmol/L。

1.4 粗酶液的制備

分別挑取甲硫氨酸氨肽酶產(chǎn)生菌11-11-16-2-5AL、11-10-18-7-AL和12-3-16-14AL的單菌落接入種子培養(yǎng)基中，于36℃搖床200 r/min培養(yǎng)6～8 h，制備種子液。將種子液按5%接種量，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于36℃搖床200 r/min培養(yǎng)24 h，為甲硫氨酸氨肽酶的發(fā)酵液。將發(fā)酵液于4℃、10 000×g離心得上清液，即為甲硫氨酸氨肽酶的粗酶液。

1.5 酶活的測(cè)定

酶活測(cè)定的原理:氨基酸對(duì)硝基苯胺溶液無(wú)色，在氨肽酶的作用下水解生成黃色的對(duì)硝基苯胺和游離的氨基酸。對(duì)硝基苯胺在紫外范圍有吸收，以紫外分光光度法測(cè)定其吸光度，計(jì)算氨肽酶的酶活。

酶活的定義:于60℃，pH 8.0，每分鐘水解氨基酸對(duì)硝基苯胺產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯胺所需的酶量，定義為一個(gè)酶活單位(U)。

常規(guī)對(duì)硝基苯胺法［11－12］:向比色管中加入2 mL NH3-NH4Cl緩沖液和1 mL底物溶液，再加入l mL稀釋一定倍數(shù)的粗酶液，60℃水浴反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束立即加入終止液6 mL，終止反應(yīng)。空白對(duì)照以蒸餾水代替粗酶液。以紫外分光光度計(jì)于380 nm測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算酶活。

酶標(biāo)板法:在酶標(biāo)板的微孔中加入40 μL NH3-NH4Cl緩沖液和20 μL底物溶液，然后加入20 μL經(jīng)適當(dāng)稀釋的粗酶液，加蓋子后置于60℃水浴反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束立即加入終止液120 μL，終止反應(yīng)?？瞻讓?duì)照以蒸餾水代替粗酶液。以酶標(biāo)儀于380 nm測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 pH對(duì)酶反應(yīng)的影響

反應(yīng)液的pH值對(duì)酶活測(cè)定的影響很大，酶在一定條件下都有其最適pH。最適pH的測(cè)定在以下50 mmol/L的緩沖液中進(jìn)行:乙酸鈉(pH 4.0～5.5)、Na3PO4(pH 6.0～7.0)、Tris－HCl(pH 7.5～8.5)和HBO3-NaCl(pH 9.0～11.0)，其它測(cè)定條件不變［13］。酶活測(cè)定結(jié)果如圖1所示。

圖1 pH對(duì)酶活的影響

從圖1可見(jiàn)3株菌的甲硫氨酸氨肽酶均在pH 8.0左右時(shí)活力最高，而當(dāng)pH低于5.5或高于10.5時(shí)未檢測(cè)到酶活，表明它們是弱堿性氨肽酶，在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿環(huán)境中失活。

2.1.2 緩沖液濃度的選擇

考察pH 8.0的濃度為10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L 和 100 mmol/L 的Tris-HCl緩沖液對(duì)氨肽酶活性的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 緩沖液濃度對(duì)酶活的影響

從圖2可知3種氨肽酶在緩沖液濃度為20～80 mmol/L的范圍內(nèi)活力較強(qiáng)，其中Tris-HCl濃度為40 mmol/L時(shí)酶活力最強(qiáng)。

2.1.3 底物溶液濃度的選擇

考察底物濃度在2～10 mmol/L范圍對(duì)酶活反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 底物濃度對(duì)酶活的影響

底物甲硫氨酸對(duì)硝基苯胺的濃度影響酶促反應(yīng)速度，從圖3可以看出，隨著底物濃度的增加三種氨肽酶的酶活也相應(yīng)升高，底物濃度達(dá)到6～7 mmol/L時(shí)酶活最高，但當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)7 mmol/L時(shí)，酶活反而降低?？紤]到底物成本，故可選擇底物濃度為6 mmol/L。

2.1.4 反應(yīng)溫度對(duì)酶活的影響

測(cè)定在10～100℃范圍內(nèi)，溫度對(duì)酶活的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 溫度對(duì)酶活的影響

隨著溫度的增加3種酶的活力也均相應(yīng)升高，當(dāng)溫度為60℃時(shí)酶活力最高。

2.1.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活測(cè)定的影響

在5～20 min的酶反應(yīng)時(shí)間范圍內(nèi)，測(cè)定酶的最佳反應(yīng)時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，酶解時(shí)間在10 min時(shí)酶活最高。

表1 酶解時(shí)間對(duì)酶活測(cè)定的影響

2.1.6 緩沖液的離子對(duì)酶活測(cè)定的影響

反應(yīng)體系中緩沖液的離子影響酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)，從而影響其催化能力，所以，測(cè)定酶活時(shí)應(yīng)盡可能統(tǒng)一反應(yīng)緩沖液的種類(lèi)和離子強(qiáng)度?？疾霮H2PO4、Tris-HCl、H3BO3-NaOH、NH3-NH4Cl、2-氨 基-2-羥 甲基-(1，3)丙二醇-HCl緩沖液對(duì)3種氨肽酶活的影響，緩沖液的濃度均為40 mmol/L，pH均為8.0，其它測(cè)定條件不變，結(jié)果如表2。在NH3-NH4Cl的緩沖液中酶活最高。

表2 緩沖液離子對(duì)酶活的影響

從上述結(jié)果可看出三種不同來(lái)源的甲硫氨酸氨肽酶酶活檢測(cè)的最適條件相同，確定甲硫氨酸氨肽酶活性測(cè)定的酶反應(yīng)條件為:40 mmol/LNH3-NH4Cl緩沖液，pH 8.0，底物甲硫氨酸對(duì)硝基苯胺濃度6 mmol/L，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間10 min。

2.2 酶標(biāo)板法與常規(guī)對(duì)硝基苯胺法的對(duì)比

2.2.1 酶標(biāo)板法和常規(guī)對(duì)硝基苯胺法的光吸收曲線(xiàn)比較

酶標(biāo)板法和常規(guī)對(duì)硝基苯胺法的光吸收曲線(xiàn)見(jiàn)圖5和圖6。2種方法的最大吸收峰均在380 nm左右，酶標(biāo)板法與常規(guī)對(duì)硝基苯胺法的光密度一致。

圖5 酶標(biāo)板法對(duì)硝基苯胺的光吸收曲線(xiàn)

2.2.2 酶標(biāo)板法和常規(guī)對(duì)硝基苯胺法線(xiàn)性范圍的比較

配制系列梯度濃度的對(duì)硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，以純水為對(duì)照，在380 nm波長(zhǎng)處，分別用酶標(biāo)板法和常規(guī)對(duì)硝基苯胺法測(cè)定對(duì)硝基苯胺的含量。以吸光度為橫坐標(biāo)，以對(duì)硝基苯胺濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，兩種方法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別如圖7、圖8。酶標(biāo)板法對(duì)硝基苯胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)滿(mǎn)足回歸相關(guān)系數(shù)0.999以上的回歸直線(xiàn)，兩個(gè)端點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的對(duì)硝基苯胺濃度為20.720～55.252 μg/mL，與常規(guī)方法一致。

圖6 常規(guī)法對(duì)硝基苯胺的光吸收曲線(xiàn)

圖7 酶標(biāo)板法測(cè)定酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖8 常規(guī)法測(cè)定酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2.3 酶標(biāo)板法和常規(guī)對(duì)硝基苯胺法酶活測(cè)定結(jié)果的比較

對(duì)三種不同來(lái)源的氨肽酶粗酶液樣品，分別用酶標(biāo)板法和常規(guī)對(duì)硝基苯胺法進(jìn)行酶活測(cè)定，每種粗酶液平行測(cè)定3次，取平均值。測(cè)定結(jié)果及2種檢測(cè)方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表3，由表3的結(jié)果可看出，酶標(biāo)板法和常規(guī)法檢測(cè)氨肽酶酶活的結(jié)果基本一致。

表3 酶標(biāo)板法和常規(guī)法酶活測(cè)定的結(jié)果對(duì)比

3 討論

目前，氨肽酶的酶活測(cè)定方法有對(duì)硝基苯胺(pNA)法及熒光底物法［14］。熒光底物法以氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)為底物，反應(yīng)一定時(shí)間，測(cè)定水解產(chǎn)物的熒光性，該法迅速靈敏，但熒光底物價(jià)格昂貴，成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)硝基苯胺法。國(guó)內(nèi)外氨肽酶的檢測(cè)多采用對(duì)硝基苯胺法，大多選擇405 nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定［12，14］，本文通過(guò)對(duì)對(duì)硝基苯胺進(jìn)行波譜掃描，確定其在380 nm具有最大吸收值，故采用380 nm的波長(zhǎng)進(jìn)行酶活測(cè)定，以提高檢測(cè)的靈敏度。

采用對(duì)硝基苯胺法測(cè)定氨肽酶酶活，通過(guò)添加氨基酸對(duì)硝基苯胺底物，可以篩選水解肽鏈N端不同氨基酸的氨肽酶及其高產(chǎn)菌。氨肽酶微量化檢測(cè)方法，與常規(guī)的對(duì)硝基苯胺法相比，操作簡(jiǎn)單方便、消耗的試劑少、檢測(cè)成本低、工作效率高，與微型化發(fā)酵培養(yǎng)相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)氨肽酶產(chǎn)生菌真正意義上的高通量篩選。

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