楊強，李新華，林子木

1(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽，110866)2(遼寧省糧食科學(xué)研究所，遼寧 沈陽，110032)

銀杏是世界上十分珍貴和古老的樹種之一，有“活化石”之美稱。我國園藝學(xué)家們也常常把銀杏與牡丹、蘭花相提并論，譽為"園林三寶"。銀杏果是銀杏樹的種子，因其中種皮為白色的硬殼，故俗稱白果［1］。銀杏果中含有豐富的營養(yǎng)成分和特異的化學(xué)物質(zhì)，多糖就是銀杏果中一種重要的活性成分。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗衰老、抗腫瘤、降血糖等多種活性作用。但除蛋白后的銀杏果多糖色澤呈橘黃色，其色澤不僅會影響到多糖的純度，還會影響到多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性的研究。因此，對銀杏果多糖進行脫色，不僅能改善多糖的外觀，而且還能為深入研究其結(jié)構(gòu)等打下基礎(chǔ)［2］。本文探討了離子交換樹脂和大孔吸附樹脂對銀杏果多糖的脫色情況，采用靜態(tài)吸附和動態(tài)吸附試驗確定了樹脂的種類，優(yōu)化了脫色工藝，取得了較好的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

銀杏果多糖(實驗室提取);脫色1號、D900、D101、HD-8、NKA9、DA-201、AB-8、S-8 型大孔樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)。

1.2 儀器設(shè)備

7200 型分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司);JD200-2型電子天平(北京塞多利斯儀器有限公司);數(shù)顯式恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);TDL-5-A型離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DZF-6050真空干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);HL-2恒流泵(上海青浦滬西儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樹脂的預(yù)處理

陽離子交換樹脂→質(zhì)量分數(shù)5%NaCl浸泡20 h→去離子水清洗至中性→質(zhì)量分數(shù)5%NaOH浸泡4 h→去離子水沖洗至中性質(zhì)量分數(shù)5%HCl浸泡4 h→去離子水沖洗至中性→烘箱中50℃烘干備用。

陰離子交換樹脂→質(zhì)量分數(shù)5%NaCl浸泡20 h→去離子水清洗至中性→質(zhì)量分數(shù)5%HCL浸泡4 h→去離子水沖洗至中性→質(zhì)量分數(shù)5%NaOH浸泡4 h→去離子水沖洗至中性→烘箱中50℃烘干備用。

吸附樹脂→質(zhì)量分數(shù)5%HCl浸泡20 h→去離子水清洗至中性→質(zhì)量分數(shù)5%NaOH浸泡4 h→去離子水沖洗至中性→質(zhì)量分數(shù)95%乙醇浸泡12 h→去離子水清洗至無醇味→烘箱中50℃烘干備用。

1.3.2 靜態(tài)吸附實驗

1.3.2.1 大孔樹脂脫色方法

取一定量處理好的樹脂，加入30 mL 2%的銀杏果多糖溶液于100 mL三角瓶中，恒溫振蕩2 h(120 r/min)。振蕩結(jié)束后，雙層濾紙過濾，5000 r/min離心20 min，考察不同樹脂對多糖溶液的脫色率、總糖保留率和蛋白質(zhì)去除率。

1.3.2.2 正交實驗

100 mL三角瓶中分別加入30 mL 2%的pH值為4.5、5.5和6.5的銀杏果多糖溶液和一定量處理好的脫色1號、D900和D101樹脂，然后將三角瓶置于25、35、45℃的恒溫振蕩箱中振蕩2 h(120 r/min)，振蕩結(jié)束后，濾紙過濾多糖溶液，溶液經(jīng)5 000 r/min離心20 min后，考察不同樹脂對提取液的脫色率、總糖保留率和蛋白質(zhì)去除率。

1.3.3 動態(tài)吸附實驗

1.3.3.1 上柱速度對脫色效果的影響

裝柱體積1BV，配制2 mg/mL的脫蛋白后的多糖溶液 1BV 上樣，選擇上樣速度為0.5，l，1.5，2.0，2.5 mL/min，再用2BV的蒸餾水淋洗，合并多糖脫色液和洗脫液，分別測其多糖、色素、蛋白質(zhì)的含量，考察上樣流速對吸附效果的影響。

1.3.3.2 上樣濃度對脫色效果的影響

裝柱體積1BV，分別稱量1 g粗多糖配成1、2、3、4、5、6 mg/mL的粗多糖溶液上柱，流速為1.5 mL/min，后用2BV的蒸餾水沖洗，合并多糖脫色液和洗脫液，分別測其多糖、色素、蛋白質(zhì)的含量，考察上樣濃度對吸附效果的影響。

1.3.3.3 柱容量對脫色效果的影響

在上柱速度為1.5 mL/min，上柱濃度為4 mg/mL條件下，考察脫色1號的柱容量。

1.3.4 分析方法

1.3.4.1 多糖測定及保留率的計算

采用苯酚-硫酸法［3］，以葡萄糖為對照品。線性回歸方程為:A=13.961c+0.0449，相關(guān)系數(shù) r=0.999。式中:A為吸光度;c為以葡萄糖計的多糖濃度(mg/mL)。

式中:m前、m后分別為脫色前后的多糖總量。

1.3.4.2 脫色率測定及計算方法

經(jīng)脫色后的待測的多糖提取液雙層濾紙過濾，5 000 r/min 離心20 min 后，分別在420、520、620 nm處測其的吸光值。

式中:OD總前、OD總后分別為脫色前后溶液在420、520、620 nm處測得的吸光值的和。

1.3.4.3 蛋白質(zhì)的測定及去除率的計算

蛋白質(zhì)測定采用考馬斯亮藍G-250法［4］測定，以牛血清白蛋白為標準品，線性回歸方程為A=0.042 82+0.001 34c，相關(guān)系數(shù) r=0.997 5。

式中:A為吸光度;c蛋白質(zhì)濃度(μg/mL)。

式中:c前、c后分別為脫色前和脫色后蛋白質(zhì)的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附法篩選樹脂實驗結(jié)果

2.1.1 樹脂的初步篩選

分別向三角瓶中加入8種一定量的樹脂和料液(30 mL)，然后放入搖床振蕩2 h(溫度45℃，轉(zhuǎn)速120 r/m in)。脫色后，濾紙過濾多糖溶液，5 000 r/min離心20 min，測定并計算料液的脫色率、總糖保留率和蛋白質(zhì)去除率，結(jié)果如表所示。

由表1可知，脫色1號、D900、DA-201C、D101四種樹脂的脫色率都在50%以上，多糖保留率也在65%以上，但 D101樹脂的蛋白質(zhì)去除率卻只有51.07%，所以選擇脫色1號、D900、DA-201C樹脂進行正交試驗，對樹脂脫色條件進一步優(yōu)化。

以上8種被考察的樹脂對色素、多糖、蛋白質(zhì)的吸附各不相同，這與樹脂的性能和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有很大的關(guān)系。從樹脂性質(zhì)上看，樹脂脫色1號、D900屬于陰離子交換樹脂，樹脂HD-8屬于陽離子交換樹脂，樹脂脫色1號、D900的脫色效果優(yōu)于樹脂HD-8，表明銀杏果多糖提取液中的色素可能屬于陰離子型。從樹脂極性來看，樹脂D101、DA-201為非極性樹脂，樹脂AB-8、S-8、NKA-9為極性樹脂，樹脂D101、DA-201的脫色效果明顯優(yōu)于樹脂AB-8、S-8、NKA-9，表明銀杏果多糖提取液中的色素可能屬于非極性分子。此外，樹脂聚合體所具有的網(wǎng)眼大小必須與銀杏果多糖中所含色素分子的大小相適應(yīng)，才能達到吸附效果，而脫色效果較差的樹脂NKA-9孔徑最大，由此推測銀杏果多糖溶液中色素主要為小分子。綜合分析銀杏果多糖提取液中的色素可能以帶負電荷的非極性小分子色素為主。

2.1.2 正交設(shè)計確定脫色的最佳工藝條件

采用正交試驗法確定銀杏果多糖溶液的最佳脫色條件，設(shè)計三因素三水平L9(33)正交試驗表，見表2。

表2 試驗因素水平表L9(33)

表3 正交試驗結(jié)果表

由表3可知，影響多糖脫色率的因素依次為A＞B＞C，即樹脂種類＞pH值＞溫度，最優(yōu)組合為A1B1C2，即樹脂種類為脫色1號，pH值為4.5，溫度為35℃;影響多糖保存率的因素依次為A＞C＞B，即樹脂種類＞溫度＞pH值，最優(yōu)組合為A1B1C3，即樹脂種類為脫色1號，pH值為4.5溫度為45℃;影響蛋白去除率的因素依次為A＞B＞C，即樹脂種類＞pH值＞溫度，最優(yōu)組合為A1B3C1，即樹脂種類為脫色1號，pH值為6.5，溫度為25℃。

綜合考慮脫色率、總糖保留率、蛋白質(zhì)去除率3個指標，得出最佳脫色條件為:脫色1號樹脂、pH值為4.5、溫度為25℃。

2.2 動態(tài)吸附實驗結(jié)果

2.2.1 上柱速度對脫色效果的影響

將濃度為2.0 mg/mL的銀杏果多糖溶液以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min 的流速分別上樣，然后測其脫色率，結(jié)果見圖1。

圖1 上樣速度對樹脂脫色的影響

由圖1可知，隨著上柱速度的增加，多糖的脫色率逐漸下降。當(dāng)上樣速度為0.5、1.0 mL/min時，脫色率非常高;當(dāng)上樣速度為2.0 mL/min時，脫色率明顯下降。從吸附理論可以解釋，流速越慢，有利于上柱液中色素分子與樹脂表面充分進行粒擴散和膜擴散，使色素分子充分被樹脂吸附;同時，流速過快，樹脂與多糖溶液接觸的時間越短，不能充分吸附其中色素，因而脫色效果較差。因此選擇上柱速度為1.5 mL/min。

2.2.2 上樣濃度對脫色效果的影響

配制濃度為 1，2，3，4，5，6 mg/mL 的銀杏果多糖溶液分別上樣，然后測其脫色率，結(jié)果見圖2。

圖2 上樣濃度對樹脂脫色的影響

由圖2可知，銀杏果多糖總量一定時，濃度越大，脫色率越低。但是當(dāng)多糖總量一定時，濃度較高的多糖溶液由于體積小反而可以縮短脫色時間，提高生產(chǎn)效率。當(dāng)多糖濃度為5 mg/mL時，脫色率明顯下降。綜合考慮脫色率以及后續(xù)試驗的濃縮工作考慮，選擇4 mg/mL濃度的銀杏果多糖溶液脫色較為合適。

2.2.3 柱容量對脫色效果的影響

在上柱速度為1.5 mL/min，上柱濃度為4 mg/mL條件下，考察脫色1號的柱容量，結(jié)果見圖3。

圖3 柱容量對樹脂脫色的影響

由圖3可知，隨著上樣量的增大，脫色率在逐漸的降低。當(dāng)上樣量在2BV時，多糖的脫色率為90.0%，當(dāng)上樣量為3BV時，脫色率也在80%以上，說明脫色1號具有較強的脫色能力。因此，選擇上樣量為2BV。

2.3 驗證試驗

綜合靜態(tài)和動態(tài)吸附試驗的結(jié)果進行3次驗證試驗，結(jié)果表明在采用脫色1號樹脂，pH值為4.5，溫度為25℃，上柱速度為1.5 mL/min，上樣濃度為選擇4 mg/mL，柱容量為2BV的條件下，多糖的脫色率為82.37%，多糖保留率為79.12%，蛋白去除率為88.39%。

3 結(jié)論

(1)采用離子交換樹脂和吸附樹脂對銀杏果多糖進行脫色，篩選出3種樹脂:大孔陰離子交換樹脂脫色1號、D900和非極性的大孔吸附樹脂DA-201C。

(2)銀杏果多糖中的色素可能以帶負電荷的非極性小分子色素為主。

(3)通過正交試驗和動態(tài)吸附試驗對脫色條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明，在采用脫色1號樹脂，pH值為4.5，溫度為25℃，上柱速度為1.5mL/min，上樣濃度為選擇4 mg/mL，柱容量為2BV的條件下，多糖的脫色率為82.37%，多糖保留率為79.12%，蛋白去除率為88.39%。

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