楊西昭 ，毛忠貴，王柯，張成明

1(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇無錫，214122)

為緩解化石能源危機，燃料乙醇在全球得到大力推廣。我國根據(jù)實際國情提出“非糧”燃料乙醇，其中木薯燃料乙醇成為重點發(fā)展項目，它呈現(xiàn)出良好的經(jīng)濟效益和社會效益［1－2］。然而生產(chǎn)1t燃料乙醇，會產(chǎn)生16 t左右的高有機濃度廢水，造成了極大的污染和水資源浪費。乙醇沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)工藝較好地解決了這一問題［2－3］。

氨氮是工藝中需要注意的重要指標(biāo)?；赜玫膮捬醭鏊械陌钡勺鳛榈礊榻湍杆?，但乙醇發(fā)酵液化和滅菌過程中氨會和還原糖產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，從而降低乙醇產(chǎn)量。另外厭氧消化產(chǎn)生氨氮的過程伴隨著堿度的產(chǎn)生，而堿度的產(chǎn)生會增加發(fā)酵液化過程硫酸的使用量。

本文研究了耦聯(lián)工藝循環(huán)過程中氨氮的變化情況，并考查了氨氮對乙醇發(fā)酵和沼氣發(fā)酵的影響。同時研究了氨氮調(diào)控工藝以期完善雙發(fā)酵耦聯(lián)工藝，為其應(yīng)用提供實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:釀酒酵母，市售安琪耐高溫活性干酵母;污泥:活性污泥，泰興市金江化學(xué)工業(yè)有限公司;原料:木薯，河南天冠企業(yè)集團(tuán);糖化酶(130 000 U/mL)耐高溫α-淀粉酶(20 000 U/mL)，無錫杰能科生物工程有限公司市售商品;其它試劑均為分析純或優(yōu)級純。

1.2 方法

1.2.1 乙醇發(fā)酵

種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，酵母膏8.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，CaCl20.06 g/L，NH4Cl 1.3 g/L。115℃，20 min 滅菌。

種子培養(yǎng)條件:接1環(huán)生長良好的斜面酵母至200 mL種子培養(yǎng)基中，在搖床上，30℃，200 r/min培養(yǎng)18 h。

原料預(yù)處理:將木薯粉碎，過40目篩，稱取木薯粉30 g加90 mL水，用2 mol/L NaOH和30%(m/m)H2SO4調(diào)節(jié)料液pH至6.0。按10 U/g木薯粉加入耐高溫 α-淀粉酶，沸水浴液化1 h。冷卻后，用 2%H2SO4調(diào)節(jié)料液pH至4.0，115℃滅菌20 min。

發(fā)酵條件:接種量10%(V/V)，尿素0.05%(m/V)，糖化酶130 U/g木薯粉，30℃，發(fā)酵時間48 h。

蒸餾廢液處理條件:待蒸餾廢水冷卻后，于5 000 r/min離心20 min，上清液加入10g/L的干酵母后4℃保存，用做厭氧發(fā)酵進(jìn)樣。

1.2.2 沼氣發(fā)酵

厭氧發(fā)酵為高溫-中溫串聯(lián)兩級沼氣發(fā)酵，蒸餾廢液首先經(jīng)過高溫厭氧處理，然后高溫厭氧出水經(jīng)過中溫厭氧處理。

高溫沼氣發(fā)酵條件:在三角瓶中發(fā)酵，發(fā)酵溫度55℃，有效體積800 mL，污泥接種量50%(V/V)，進(jìn)樣量40 mL/d。

中溫沼氣發(fā)酵條件:在三角瓶中發(fā)酵，發(fā)酵溫度35℃，有效體積400 mL，污泥接種量50%(V/V)，進(jìn)樣量40 mL/d。

沼氣收集:排水法收集沼氣。

高、中溫出水處理:5 000 r/min離心20 min后收集上清液于4℃保存，高溫出水用做中溫厭氧發(fā)酵進(jìn)樣，中溫出水用做乙醇發(fā)酵配料。

1.2.3 氨氮調(diào)控工藝

在調(diào)控工藝中對蒸餾廢液進(jìn)行固液分離以去除其中的酵母細(xì)胞。55℃下對中溫厭氧出水通空氣2h進(jìn)行脫氨處理以去除氨氮。對照工藝中固液分離后的酵母損失通過向清液中添加活性干酵母來彌補(如圖1所示)。

圖1 調(diào)控工藝與對照工藝示意圖

1.2.4 分析方法

COD:重鉻酸鉀滴定法［4］。

氨氮:靛酚藍(lán)反應(yīng)法［4］。

乙醇度:等體積蒸餾法［5］。

堿度:0.02 mol/L 鹽酸滴定法［4］。

pH:pH測定儀。

乙醇、甘油:高效液相色譜法(HPLC)檢測。

色譜條件:美國 Dionex UltiMate 3000 HPLC，示差折光檢測器日本Shodex RI-101，紫外檢測器Dionex UltiMate 3000，分析柱Bio-Rad HPX-87 H離子交換柱，柱溫60℃，流動相0.005 mol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量 20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同工藝中氨氮的變化

乙醇蒸餾廢液中的酵母菌體、未利用完的氮源、原料夾帶的氮是廢水中氨氮的主要來源。蒸餾廢液中的氮主要以有機氮形式存在，通過厭氧消化階段的氨化作用轉(zhuǎn)化為氨氮。由于耦聯(lián)工藝中革除了好氧生物處理工藝，所以不能通過硝化與反硝化作用去除氨氮［6］，只能依賴于厭氧沼氣發(fā)酵過程中氣液兩相中氨(NH3)的平衡來實現(xiàn)氨氮去除。但在乙醇發(fā)酵過程中，pH在4.0～6.0，氨氮以NH4+存在，因而無法通過乙醇發(fā)酵過程中CO2的逸出去除，所以，在耦聯(lián)工藝中出現(xiàn)氨氮的累積。如圖2所示，在循環(huán)進(jìn)行至第7批時，氨氮濃度在811 mg/L處達(dá)到平衡。而在調(diào)控工藝中，氨氮濃度無明顯增幅，穩(wěn)定在350 mg/L左右，較對照工藝下降了130%，這說明調(diào)控較大程度地減少了氨氮的累積。

圖2 不同循環(huán)工藝中中溫出水中氨氮的變化

2.2 調(diào)控工藝對乙醇發(fā)酵的影響

如圖3所示，對照工藝中乙醇產(chǎn)量在第4批后出現(xiàn)明顯下降，即氨氮濃度累積至550 mg/L時乙醇產(chǎn)量下降。而調(diào)控工藝中乙醇產(chǎn)量維持穩(wěn)定。對于乙醇發(fā)酵過程的主要副產(chǎn)物甘油，在對照工藝中的第4批后有明顯下降趨勢，至第7批時，乙醇產(chǎn)量較控制組已降低10%，說明氨氮的控制對系統(tǒng)起到了明顯的調(diào)控作用，也證明了氨氮調(diào)控的必要性。另外調(diào)控工藝中甘油產(chǎn)量維持穩(wěn)定。相關(guān)文獻(xiàn)［7－8］表明，氨氮本身不會對酵母生長產(chǎn)生影響，并且可作為氮源利用。但是在液化、滅菌等過程中氨與葡萄糖等還原糖會產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致參與乙醇發(fā)酵的糖總量降低，從而造成乙醇產(chǎn)量下降。為了證明該結(jié)論，對經(jīng)液化和滅菌的培養(yǎng)基中還原糖的含量進(jìn)行了測定分析，還原糖的含量約為50 g/L。但是由于還原糖測定方法(菲林試劑滴定法)的系統(tǒng)誤差較大，造成對照組和控制組培養(yǎng)基中的還原糖含量無明顯差別。于是我們配制葡萄糖濃度為50g/L的溶液和氨氮濃度分別為100 mg/L、350 mg/L、500 mg/L的溶液，并模擬液化和滅菌過程，以分析葡萄糖含量的變化情況。當(dāng)氨氮濃度為100 mg/L時葡萄糖無明顯減少;300 mg/L時葡萄糖減少量約為1.0 g/L;濃度達(dá)到500 mg/L時，葡萄糖濃度降低了4.4 g/L，約為總濃度的8%。美拉德反應(yīng)過程中會產(chǎn)生α-氨基酮、醛等中間產(chǎn)物，最終生成類黑素，這些物質(zhì)會對酵母生長造成不利影響［9－10］。另外循環(huán)過程中累積的一些乙醇發(fā)酵抑制物，也是導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量下降的原因之一。而氨氮調(diào)控工藝在避免氨氮累積的同時，也去除了這些抑制物，鞏固了乙醇產(chǎn)量的穩(wěn)定。

圖3 不同工藝中乙醇及甘油產(chǎn)量的變化

2.3 調(diào)控工藝對沼氣發(fā)酵的影響

圖2和圖3表明氨氮調(diào)控工藝起到了很好的調(diào)控作用，但是實際生產(chǎn)的要求更高，既要保證乙醇產(chǎn)量的穩(wěn)定，又要保證沼氣發(fā)酵的穩(wěn)定運行。因此又考察了中溫厭氧出水pH、COD、堿度等重要水質(zhì)指標(biāo)及沼氣產(chǎn)量的變化情況。

2.3.1 中溫出水pH值的變化情況

如圖4所示，2種工藝的中溫出水pH均為7.5～8.0，對照工藝中pH因氨氮的持續(xù)增多略微上升，調(diào)控工藝后4個循環(huán)批次pH值有略微下降趨勢，但屬于正常波動。沼氣發(fā)酵環(huán)境中的pH主要受有機酸的影響，發(fā)酵產(chǎn)酸階段和產(chǎn)甲烷階段都不會受到氨氮的直接影響［11］，即有機酸的產(chǎn)生與降解都不會受到氨氮的直接影響，因此厭氧體系中的pH值保持穩(wěn)定。

2.3.2 中溫出水COD的變化情況

圖4 不同循環(huán)工藝中高溫出水、中溫出水pH值的變化

本研究采用高溫、中溫兩級沼氣發(fā)酵體系。乙醇蒸餾廢液進(jìn)入高溫反應(yīng)器進(jìn)行處理，然后高溫出水進(jìn)入中溫反應(yīng)器進(jìn)一步處理。乙醇蒸餾廢液離心后上清液的COD約為20 000 mg/L。如圖5所示，兩種工藝的中溫出水COD都在2 200 mg/L左右，即經(jīng)過高、中溫2級厭氧處理后，達(dá)到了80%以上的COD去除率。圖4和圖5的結(jié)果表明，氨氮的累積沒有直接影響到厭氧體系中微生物對有機物的降解，即本研究中氨氮沒有影響沼氣厭氧發(fā)酵的正常進(jìn)行。

圖5 不同循環(huán)工藝中中溫出水COD的變化

2.3.3 中溫出水堿度的變化情況

有機氮通過微生物氨化作用轉(zhuǎn)化為氨氮的過程中，會引起厭氧環(huán)境中堿度的產(chǎn)生。如圖6所示，對照工藝中的堿度明顯高于調(diào)控工藝。在第3個循環(huán)批次以后，調(diào)控工藝中的堿度達(dá)到穩(wěn)定，處于2 700～3 000 mg CaCO3/L，而對照工藝中堿度呈上升趨勢，在循環(huán)至第7批時，其濃度達(dá)到3 900 mg CaCO3/L。這是由于在氨化反應(yīng)的同時會產(chǎn)生堿度物質(zhì)［12］。而堿度的累積會造成乙醇發(fā)酵時調(diào)酸用H2SO4使用量的增加，進(jìn)而引入過多的SO42－，而過多的 SO42－會對沼氣發(fā)酵造成不良影響［13］。

2.3.4 沼氣產(chǎn)量的變化情況

進(jìn)一步考察了2種工藝中沼氣產(chǎn)量的變化情況。如圖7所示，在7個循環(huán)批次中兩種工藝的沼氣產(chǎn)量出現(xiàn)相同趨勢的波動，但總的沼氣產(chǎn)量基本持平。(收集裝置的氣密性欠佳，造成第3、5批的沼氣收集量下降)相關(guān)文獻(xiàn)［14］表明，氨氮濃度在800 mg/L左右時可促進(jìn)產(chǎn)甲烷菌活力，但氨氮濃度進(jìn)一步升高達(dá)到1 500 mg/L以上時，則會影響產(chǎn)甲烷菌活力。本研究中沒用出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。

圖6 不同循環(huán)工藝中中溫出水堿度的變化

圖7 不同工藝中沼氣產(chǎn)量的變化(沼氣產(chǎn)量為高、中溫沼氣產(chǎn)量總和)

3 結(jié)論

隨著循環(huán)批次的增加，氨氮會形成累積，循環(huán)至第7批次時其濃度達(dá)到811 mg/L。而在氨氮調(diào)控工藝中，氨氮累積得到較好遏制，濃度穩(wěn)定在350 mg/L左右。氨氮的累積會對乙醇發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用，因為氨與還原糖產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致乙醇發(fā)酵時總糖量減少，乙醇產(chǎn)量下降。但氨氮的累積沒有對厭氧體系中的pH、COD、沼氣產(chǎn)量造成影響，只是間接造成堿度的上升。綜上所述，氨氮調(diào)控工藝對氨氮起到了良好的調(diào)控作用，并且可以穩(wěn)定地循環(huán)運行。

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