劉 偉， 許賓賓， 曹樹(shù)穩(wěn)

(1. 伊犁師范學(xué)院 化學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，新疆 伊寧 835000； 2. 南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

水飛薊素是指從菊科藥用植物水飛薊種子的種皮中提取得到的一類(lèi)黃酮木脂素[1]。水飛薊賓(1)作為其主要的活性成分不僅具有保肝利膽作用[2]，還具有明顯的清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗癌和抗炎作用[3]。黃酮類(lèi)化合物分子具有典型的親脂性弱特征，嚴(yán)重限制了其透過(guò)具有豐富脂質(zhì)小腸外膜的能力[4]，從而難以被胃腸道吸收進(jìn)入組織細(xì)胞，極大的限制了其臨床應(yīng)用，也給適應(yīng)性新藥的尋找與開(kāi)發(fā)帶來(lái)相當(dāng)大的困難。1的臨床應(yīng)用同樣也受到吸收性差，生物利用度低的限制。通過(guò)糖苷化、酯化和?；确椒▽?duì)1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行衍生化[5～7]，可改善1的溶解性，達(dá)到提高活性和生物利用度的目的。

本文將1含有親水性基團(tuán)的N-芐氧羰基-甘氨酸通過(guò)DCC/DMAP促進(jìn)偶合法合成了一個(gè)新型的水飛薊賓衍生物——(N-芐氧羰基-甘氨酸-3-水飛薊賓酯(2， Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV，1H NMR， IR和ESI-MS表征。采用化學(xué)和生物模型考察了1和2的清除自由基能力和抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力。

1 2

Scheme1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(EtOH為溶劑)；L-2000型高效液相色譜儀(HPLC)； Bruker AV-600型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Nicolet FT-IR 5700型傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)；Waters ZQ 4000/2695型氣-質(zhì)聯(lián)用儀。

1(95%)，遼寧盤(pán)錦格林恩生物資源開(kāi)發(fā)有限公司；N-芐氧羰基-甘氨酸，N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)， 4-二甲氨基吡啶(DMAP)，上海吉爾生化有限公司；1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)，長(zhǎng)城生物化學(xué)工程有限公司；水溶性維生素E(Trolox)， Sigma公司；大鼠肝微粒體，廈門(mén)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)院；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或色譜純，其中乙腈和丙酮使用前需作無(wú)水處理。

1.2 2的合成

在反應(yīng)瓶中加入1 2.41 g(5 mmol)的無(wú)水丙酮(30 mL)溶液，攪拌下于0 ℃～4 ℃依次加入N-芐氧羰基-甘氨酸1.25 g(6 mmol)的無(wú)水丙酮(15 mL)溶液， DMAP 73 mg(0.6 mmol);待溶液澄清后，于30 min內(nèi)緩慢滴加DCC 1.03 g(5 mmol)的無(wú)水丙酮(10 mL)溶液，滴畢，反應(yīng)1 h。升至室溫，再滴加DCC 206 mg(1 mmol)的無(wú)水丙酮(2 mL)溶液，滴畢，反應(yīng)4 h(TLC跟蹤)。三次過(guò)濾,濾液減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠短柱快速柱層析[洗脫劑：V(氯仿) ∶V(丙酮) ∶V(冰醋酸)=20.0 ∶1.0 ∶0.1]純化得白色黏稠物，經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(冰醋酸)=30.0 ∶1.0 ∶0.1]純化得白色粉末2，收率37.5%； UVλ: 205.2， 288.3 nm；1H NMRδ： 11.41(s, 1H, 5-OH)， 11.06(s, 1H, 7-OH)， 9.18(s, 1H, 20-OH)， 8.31(s, 1H, NH)， 6.80～7.80(m, 11H, ArH)， 6.01(m, 1H, 3-H)， 5.98(d,J=1.8 Hz, 1H， 6-H)， 5.94(m, 1H, 8-H)， 5.52(d,J=12 Hz, 1H， 2-H)， 5.03(s, 2H, NCH2)， 4.99(t, 1H, 11-H)， 4.92(t, 1H, 23-OH)， 4.20(m, 1H, 10-H)， 3.78(s, 3H, 19-OCH3)， 3.55(m, 1H, 23-Ha)， 3.42(s, 2H, ArCH2)，3.34(m, 1H, 23-Hb)； IRν: 3 419(OH)， 2 921(CH3)， 1 756， 1 710(C=O)， 1 638(C=O)， 1 513(ArH)， 1 458(ArH)， 1 374(CH3)， 1 276(O-Ar)， 1 171， 1 082， 1 030， 825， 740， 677 cm-1； MSm/z： 672{[M-H]-}， 674{[M+H]+}， 696{[M+Na]+}， 712{[M+K]+}。

1.3 活性研究

(1) 清除DPPH自由基測(cè)試[8]

將藥樣乙醇溶液(c=0.8, 1.6, 2.4, 3.2, 4.0 mmol·L-1)0.5 mL置10 mL比色皿中，分別加入0.5 mL 0.6 mmol·L-1的DPPH乙醇溶液，用乙醇定容至5 mL。取0.5 mL的DPPH緩沖液用乙醇定容至5 mL做對(duì)照試驗(yàn)(以乙醇溶液做空白)。室溫下避光放置30 min，測(cè)定藥樣在517 nm處的吸光度A(每組樣品進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值)。按下式計(jì)算DPPH清除率(DPPH RSA)：

(2) 肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化模型測(cè)試[9]

以無(wú)水乙醇為溶劑，分別將1， 2和陽(yáng)性對(duì)照品Torlox配成濃度分別為10, 20, 30, 40 μmol·L-1的溶液。在10 mL比色管內(nèi)依次加入1.0 mL線(xiàn)粒體懸液，0.5 mL藥樣溶液，0.25 mL Trolox和0.25 mL Fe2+溶液，置37 ℃水浴中振蕩孵育1 h；加入20% TCA終止反應(yīng)。添加2 mL 0.67% TBA，于95℃(浴溫)顯色30 min；離心(3 500 r·min-1)10 min；取上清液于532 nm測(cè)定吸光值，每組實(shí)驗(yàn)做三次平行取其平均值。陽(yáng)性對(duì)照組添加溶液為1.0 mL線(xiàn)粒體懸液，0.5 mL蒸餾水，0.25 mL Trolox和0.25 mL Fe2+溶液；參比組添加溶液為1.0 mL線(xiàn)粒體懸液和1.0 mL蒸餾水。按下式計(jì)算抗氧化率：

2 結(jié)果與討論

不同的溶劑會(huì)影響反應(yīng)速率和產(chǎn)率，甚至改變反應(yīng)進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)考察了乙腈、丙酮和DMF對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果表明,常溫下1在乙腈中溶解性較差，在DMF中溶解性最好，但在TLC跟蹤監(jiān)測(cè)時(shí)拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，DMF在產(chǎn)物中的殘留亦難除去；反應(yīng)在丙酮中可以順利進(jìn)行。綜合考慮確定丙酮為反應(yīng)溶劑。由于1的羥基較多，部分副產(chǎn)物物化性質(zhì)相近，后續(xù)多次純化造成2的收率偏低。

c/mmol·L-1圖1 1和2的清除DPPH活性Figure 1 DPPH scavenging activities of 1 and 2

c/μmol·L-1圖2 1和2的抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性Figure 2 Inhibition of lipid peroxidantion of 1 and 2

1和2的清除DPPH自由基活性和抗脂質(zhì)過(guò)氧能力分別見(jiàn)圖1和圖2。從由圖1和圖2可見(jiàn)，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，2比1具有更好的清除DPPH活性和抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力。表現(xiàn)出濃度依賴(lài)性，隨著濃度逐漸增大，其活性體現(xiàn)為先提高后趨于穩(wěn)定。

[1] K?en V, Ga?ák R, Purchartová K,etal． Chemoen zymatic preparative separation of silybins A and B[J].J.Mol Catal B:Enzym,2009,61(3-4):247-251.

[2] Ball K R， Kowdley K V． A review of silybum marianum(milk thistle) as a treatment for alcoholic liver disease[J].J Clin Gastroenterol,2005,39(6):520-528.

[3] Singh R P, Agarwal R. Flavonoid antioxidant silymarin and skin cancer[J].Antioxid Redox Sign,2002,4(4):655-663．

[4] Kidd P, Head K. A review of the bioavailability and clinical efficacy of milk thistle phytosome:A silybin-phosphatidylcholine complex[siliphos(r)][J]. Altern Med Rev,2005,10(3):193-203.

[5] Kren V, Kubisch J, Sedmera P,etal. Glycosylation of silybin[J].J Chem Soc Perk T 1,1997,17:2467-2474.

[6] 劉偉，余燕影，曹樹(shù)穩(wěn)． 新型水飛薊賓乙酰阿魏酸單酯的合成[J]．合成化學(xué)，2011，19(3)：349-351．

[7] 朱琳，李偉，李金柱． 水飛薊賓乙?；锏倪x擇性合成[J]．合成化學(xué)，2009，17(2)：262-264．

[8] Liu W, Yu Y Y, Yang R Z,etal. Optimization of total flavonoid compound extraction from gynura medica leaf using response surface methodology and chemical composition analysis[J].Int J Mol Sci,2010,11(11):4750-4763.

[9] Yang Q M, Pan X H, Kong W B,etal. Antioxidant activities of malt extract from barley(hordeum vulgare l.) toward various oxidative stress in vitro and in vivo[J].Food Chem,2010,118(1):84-89.