張 然, 許 潔, 趙麗嬌, 鐘儒剛

(北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,北京 100124)

堿基修飾是DNA損傷的一種重要形式。外源化學(xué)致癌物或者藥物進(jìn)入生物體內(nèi)后,與細(xì)胞內(nèi)的DNA發(fā)生作用生成各種不同結(jié)構(gòu)的堿基修飾產(chǎn)物,造成DNA分子結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的變化,進(jìn)而可能導(dǎo)致DNA斷鏈、交聯(lián)、堿基錯(cuò)誤配對(duì)等損傷[1]。堿基的烷化修飾是DNA在親電試劑作用下生成的一種常見(jiàn)損傷產(chǎn)物,一些致癌物(如丁烯醛、亞硝胺)就是通過(guò)導(dǎo)致DNA堿基的烷化修飾而誘發(fā)癌癥的[2～4]。堿基烷化產(chǎn)物一般都形成于堿基的親核部位,其中鳥(niǎo)嘌呤的N7-位是親核位點(diǎn)中最活潑的。N7-鳥(niǎo)嘌呤烷化物是致癌或者抗癌過(guò)程中的重要分子標(biāo)記物[5，6],其在動(dòng)物體內(nèi)的生成機(jī)理、分析檢測(cè)方法和體外制備方法是化學(xué)、藥學(xué)和毒理學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。 比如,亞硝胺是一類重要的致癌物質(zhì),研究表明其在細(xì)胞色素P450作用下代謝活化生成α-羥基亞硝胺,然后經(jīng)分解生成活潑親電試劑烷基重氮鹽離子,進(jìn)而導(dǎo)致鳥(niǎo)嘌呤的烷化損傷[7，8]。一些藥物也能夠?qū)е翫NA堿基的烷化修飾,比如臨床上用于治療淋巴瘤的氮芥和用于治療腦瘤的亞硝基脲,均能夠?qū)е馒B(niǎo)嘌呤烷化進(jìn)而引起DNA交聯(lián)[9]。Osborne等[10]研究表明,N,N-2-氯乙基甲胺可誘導(dǎo)大馬哈魚(yú)睪丸DNA生成兩種N7-鳥(niǎo)嘌呤烷化物和以其為中間體的兩種交聯(lián)物。Bodell[11～13]報(bào)道氯乙基亞硝基脲和DNA反應(yīng)能生成13種DNA損傷產(chǎn)物,其中包括堿基烷化修飾物N7-(2-羥乙基)鳥(niǎo)嘌呤(3a)和N7-(2-氯乙基)鳥(niǎo)嘌呤(3b),并且3a和3b的含量明顯高于其它烷化產(chǎn)物,說(shuō)明鳥(niǎo)嘌呤N7-位最容易受到烷基重氮鹽離子的進(jìn)攻。

13a～3e

Scheme1

本文以脫氧鳥(niǎo)苷(1)為原料,建立了3a,3b,N7-(2-溴乙基)鳥(niǎo)嘌呤(3c),N7-乙基鳥(niǎo)嘌呤(3d)和N7-烯丙基鳥(niǎo)嘌呤(3e)的合成方法(Scheme 1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV,1H NMR, IR和MS確證。并以3a～3e為標(biāo)準(zhǔn)品,采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)對(duì)1,3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲(卡莫司汀)導(dǎo)致的鳥(niǎo)嘌呤烷化損傷產(chǎn)物進(jìn)行了分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

BRUKER AC-P400型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo));BRUKER VERTEX 70型傅里葉變換紅外光譜儀(KBr壓片);Thermo-Fisher TSQ Quantum型高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-MS)。

1,東京化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社;小牛胸腺DNA(ctDNA),卡莫司汀、蛇毒磷酸二酯酶、乙腈、硫酸二乙酯,Sigma; 3-溴-1-丙烯(2e), Acros Organics; 1-溴-2-氯乙烷(2b), 1,2-二溴乙烷(2c),J & K CHEMICA;脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ), S1核酸酶和牛腸堿性磷酸酶(CIAP), TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司;硅膠200目～ 300目;其余所用試劑均為分析純。

1.2 3的合成(以3a為例)

在圓底燒瓶中依次加入1101.4 mg(0.38 mmol),環(huán)氧乙烷(2a) 250 μL(4.94 mmol)和冰醋酸1 mL,攪拌下于37 ℃反應(yīng)1 h。減壓蒸去溶劑后經(jīng)硅膠柱層析[梯度洗脫劑: A=V(甲醇) ∶V(乙酸乙酯)=1 ∶20～1 ∶9]純化得白色固體3a54.9 mg。

用類似方法合成白色固體3b～3e。

3a: UVλmax: 240, 284 nm;1H NMRδ: 3.69～3.71(m, 2H, 11-H), 4.13～4.14(m, 2H, 10-H), 6.39(s, 2H, NH2), 8.09(s, 1H, 8-H); IRν: 3 489, 3 326, 2 960, 2 931, 2 873, 1 729, 1 656, 1 469, 1 447, 1 388, 1 123, 1 073 cm-1; ESI-MSm/z: 196.1{[M+H]+, 100%}。

3b[二甲亞砜(1 mL)為溶劑,梯度洗脫劑: A=1 ∶20～1 ∶10]: UVλmax: 246, 284 nm;1H NMRδ: 4.04～4.06(m, 2H, 11-H), 4.50～4.53(m, 2H, 10-H), 6.19(s, 2H, NH2), 7.98(s, 1H, 8-H), 10.89(s, 1H, NH); IRν: 3 326, 3 960, 2 932, 2 874, 1 733, 1 681, 1 469, 1 385, 1 281, 1 122, 1 074, 777 cm-1; ESI-MSm/z: 214.0{[M+H]+, 100%}, 216.1{[M+H]+, 33%}。

3c[二甲亞砜(1 mL)為溶劑,梯度洗脫劑: A=1 ∶20～1 ∶10]: UVλmax: 243, 285 nm;1H NMRδ: 3.17～3.18(m, 2H, 11-H), 3.34～3.36(m, 2H, 10-H), 6.13(s, 2H, NH2), 7.95(s, 1H, 8-H); IRν: 3 326, 3 170, 2 963, 2 934, 1 731, 1 683, 1 613, 1 472, 1 387, 1 288, 1 124, 1 076, 746, 699 cm-1; ESI-MSm/z: 258.0{[M+H]+, 100%}, 260.0{[M+H]+, 98%}。

3d[硫酸二甲酯200 mg(1.59 mmol),N,N-二甲基乙酰胺(1 mL)為溶劑,梯度洗脫劑: A=1 ∶20～1 ∶10]: UVλmax: 247, 283 nm;1H NMRδ: 2.52～2.55(m, 3H, 11-H), 4.05～4.16(m, 2H, 10-H), 6.81(s, 2H, NH2), 6.95(s, 1H, 8-H); IRν: 3 432, 3 317, 3 155, 2 922, 2 871, 1 691, 1 658, 1 560, 1 387, 1 267, 1 214, 1 014, 939 cm-1; ESI-MSm/z: 180.1{[M+H]+, 100%}。

3e[二甲亞砜(1 mL)為溶劑,梯度洗脫劑: A=1 ∶20～1 ∶9]: UVλmax: 247, 285 nm;1H NMRδ: 5.18～5.21(m, 2H, 12-H), 5.70～5.93(m, 1H, 11-H), 4.53～4.68(m, 2H, 10-H), 7.02(s, 2H, NH2), 8.03(s, 1H, 8-H); IRν: 3 429, 3 328, 3 165, 2 955, 2 922, 1 683, 1 640, 1 559, 1 476, 1 383, 1 207 cm-1; ESI-MSm/z: 192.1{[M+H]+, 100%}。

1.3 3在DNA損傷檢測(cè)中的應(yīng)用

在反應(yīng)瓶中依次加入1 mg·mL-1ctDNA溶液10 mL和二氯乙基亞硝基脲(BCNU) 2 mg，攪拌下于37 ℃避光反應(yīng)12 h。取反應(yīng)液0.2 mL，用無(wú)水乙醇(0.4 mL)析出ctDNA;離心分離，沉淀用75%乙醇漂洗兩次;加入Tris-HCl緩沖溶液0.2 mL制得與BCNU反應(yīng)的ctDNA溶液。將ctDNA溶液于98 ℃熱變性5 min,迅速放入冰浴中冷卻10 min(使ctDNA雙鏈變性為單鏈)。依次加入DNaseⅠ 5 μL(300 U), S1核酸酶 5 μL(1000 U), S1核酸酶緩沖液(10 mmol·L-1NaOAc, 150 mmol·L-1NaCl, 0.05 mmol·L-1ZnSO4, pH 4.6) 20 μL,于37 ℃酸性酶解3 h。加入堿性磷酸酶(CIAP) 5 μL(150 U),蛇毒磷酸二酯酶10 μL (1U), CIAP緩沖液(500 mmol·L-1Tris HCl, 10 mmol·L-1MgCl2, pH=9.0) 50 μL, 于37 ℃堿性酶解3 h。用濃鹽酸調(diào)至pH 1.0,于95 ℃反應(yīng)1 h(使脫氧核糖核酸脫糖)。酶解液經(jīng)MicroconYM-10離心過(guò)濾，濾液即為含烷化物的樣品溶液。

HPLC測(cè)試條件:Thermo ODS C18反相柱(2.1×150 mm, 5 μm),柱溫25 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm;流動(dòng)相為2 mmol·L-1AcONH4水溶液(A)和乙腈(B)。洗脫梯度為:Q=V(B) ∶V(A)=5 ∶95, 0 min～5 min; Q=5 ∶95～15 ∶85, 5 min～20 min; Q=15 ∶85～20 ∶80, 20 min～22 min; Q=20 ∶80～5 ∶95, 22 min～23 min; Q=5 ∶95, 23 min～30 min。流速0.2 mL·min-1,進(jìn)樣量25 μL。

采用選擇反應(yīng)掃描(SRM)對(duì)DNA損傷產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 3的合成與純化

合成均在無(wú)水條件下進(jìn)行,所用試劑需無(wú)水或進(jìn)行無(wú)水處理。為了提高1的轉(zhuǎn)化率,所用烷化劑(2a～2e)均過(guò)量。在合成3a時(shí),由于環(huán)氧乙烷(2a)的沸點(diǎn)為11 ℃,常溫下極易揮發(fā),因此吸取轉(zhuǎn)移環(huán)氧乙烷的整個(gè)過(guò)程需要在冰箱中進(jìn)行。曾參考文獻(xiàn)[14]方法合成3a，但未得到產(chǎn)物。本研究在文獻(xiàn)[14]方法的基礎(chǔ)上將反應(yīng)溫度由100 ℃降至37 ℃,反應(yīng)5 min左右HPLC-MS即檢測(cè)到3a的色譜峰;再每隔20 min取樣10 μL,用甲醇(1 mL)稀釋后經(jīng)HPLC-MS檢測(cè),比較3a色譜峰的峰面積,確定最佳反應(yīng)時(shí)間為1 h。

在3c的合成中,隨反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng),會(huì)副產(chǎn)1-[N-(2-脫氧胞基)]-2-[N-(2-脫氧鳥(niǎo)基)]乙烷,從而降低產(chǎn)率,因此反應(yīng)時(shí)間控制在48 h。經(jīng)過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的優(yōu)化,合成3b和3c的最佳反應(yīng)溫度為40 ℃。3a～3e均經(jīng)硅膠柱層析純化,其中3a所用洗脫劑的極性略大,以便加快洗脫速度,得到的洗脫液中3a的含量較高,靜置后會(huì)有少量白色固體析出。

2.2 經(jīng)BCNU處理的DNA中3的檢測(cè)

以3a～3e為標(biāo)準(zhǔn)品,選擇SRM掃描模式對(duì)BCNU-DNA酶解液進(jìn)行HPLC-MS定性分析。對(duì)3a～3e分別監(jiān)測(cè)離子通道m(xù)/z196→152,m/z214→152,m/z258→152,m/z192→152和m/z180→152。

在用HPLC-MS檢測(cè)BCNU處理的DNA溶液時(shí)，通道m(xù)/z196→152和m/z214→152的離子流圖中有明顯的譜峰，對(duì)應(yīng)N7-(2-羥乙基)鳥(niǎo)嘌呤和N7-(2-氯乙基)鳥(niǎo)嘌呤,且出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品3a和3b的出峰時(shí)間一致,分別為3.23 min和11.75 min;除了這兩個(gè)峰以外,在6.06 min處還有一個(gè)峰,對(duì)應(yīng)m/z196→152的離子碎裂方式,推測(cè)為O6-(2-羥乙基)鳥(niǎo)嘌呤。

以上結(jié)果表明,BCNU和ctDNA反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致N7-鳥(niǎo)嘌呤烷化,生成N7-(2-羥乙基)鳥(niǎo)嘌呤和N7-(2-氯乙基)鳥(niǎo)嘌呤。

本研究為進(jìn)一步對(duì)鳥(niǎo)嘌呤N7-位烷化損傷的質(zhì)譜定量分析提供了參考。

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