姜華 王曉華

三氧化二砷與還原性谷胱甘肽聯(lián)用誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞株增殖與凋亡的研究

姜華 王曉華

目的 分析研究三氧化二砷與還原型谷胱甘肽聯(lián)用對(duì)人急性髓性白血病HL-60細(xì)胞株增殖與凋亡的影響，并初步探討其誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞增殖與凋亡的機(jī)制。方法 使用CCK8檢測(cè)細(xì)胞存活率，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)條件下，隨著濃度增加，三氧化二砷作用下HL-60細(xì)胞增殖有所下降，還原型谷胱甘肽作用下HL-60細(xì)胞增殖呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。同步給藥在相同三氧化二砷濃度下，隨著還原型谷胱甘肽濃度增加，細(xì)胞存活率有所提高，說明還原型谷胱甘肽可以拮抗三氧化二砷對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用。由流式檢測(cè)凋亡率結(jié)果提示，還原型谷胱甘肽提前給藥增加三氧化二砷對(duì)HL-60細(xì)胞的促凋亡作用。結(jié)論 還原型谷胱甘肽拮抗三氧化二砷對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用，而提前給藥可增加其對(duì)三氧化二砷的促凋亡作用。

細(xì)胞凋亡;細(xì)胞增殖;三氧化二砷;還原型谷胱甘肽;白血病

三氧化二砷用于治療急性早幼粒白血病最先在我國(guó)獲得成功，尤其對(duì)于難治、復(fù)發(fā)的APL效果突出，其主要機(jī)理是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而氧化應(yīng)激一直被認(rèn)為是三氧化二砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵原因。還原性谷胱甘肽是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的小分子三肽化合物，由谷氨酸、甘氨酸及半胱氨酸組成，參與細(xì)胞內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、糖代謝和DNA合成調(diào)節(jié)。它既是細(xì)胞自由基的清除劑又可作為一種氧化物前體，參與著機(jī)體氧化應(yīng)激過程。本實(shí)驗(yàn)旨在探討三氧化二砷與還原性谷胱甘肽聯(lián)合用藥對(duì)HL-60細(xì)胞株增殖與凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人白血病細(xì)胞(HL-60)由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由碧云天提供，CCK-8試劑盒由日本同仁化學(xué)研究所提供，瑞氏-姬姆薩染色試劑盒由南京建成科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞傳代培養(yǎng) HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的改良1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，實(shí)驗(yàn)均選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2 CCK-8檢測(cè) ①單因素實(shí)驗(yàn)組分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h;正交實(shí)驗(yàn)組以及不同給藥方式對(duì)HL-60細(xì)胞存活率影響實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)時(shí)間依據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)樣本編號(hào)表(表1)。②培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)到達(dá)后，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，450 nm下測(cè)定吸光度值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。1.2.3 瑞氏-姬姆薩染色 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞涂片經(jīng)瑞氏工作液染色1分鐘，再加吉姆薩工作液染色20分鐘后自然風(fēng)干，光鏡下觀察凋亡小體。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 ①800 rpm離心10 min收集細(xì)胞，小心吸除上清，加入1 ml冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，800 rpm離心10 min收集細(xì)胞，小心吸除上清，殘留約50 μl左右的PBS，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。②加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min。③800 rpm離心10 min收集細(xì)胞，小心吸除上清，殘留約 50 μl左右的液體，加入190 μl Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。④加入10 μl Annexin碘化丙啶染色液，輕輕混勻。冰浴避光放置。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

表1 實(shí)驗(yàn)樣本編號(hào)分組

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 由直觀分析表中極差值可以得出，隨著濃度增加，三氧化二砷作用下HL-60細(xì)胞增殖有所下降，還原型谷胱甘肽作用下HL-60細(xì)胞增殖呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。

2.2 由三氧化二砷和還原型谷胱甘肽的交互作用表可以得出，同步給藥，在同一三氧化二砷濃度下，隨著還原型谷胱甘肽濃度增加，細(xì)胞存活率有所提高，說明還原型谷胱甘肽可以拮抗三氧化二砷對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用。

2.3 光鏡下觀察，HL-60細(xì)胞經(jīng)加藥處理后出現(xiàn)部分細(xì)胞被染深藍(lán)色現(xiàn)象，說明出現(xiàn)細(xì)胞凋亡情況;且單獨(dú)加As2O3組，細(xì)胞凋亡明顯。

2.4 不同藥物作用后HL-60細(xì)胞流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化，見圖1。

圖1 流式細(xì)胞圖

3 討論

目前治療白血病的主要手段仍是化療，但化療藥物在摧毀白血病細(xì)胞克隆的同時(shí)，也抑制正常骨髓的造血功能，骨髓抑制期發(fā)生的貧血、出血、感染、臟器損害等合并癥，是化療后患者死亡的主要原因?；熕幬锍３Ｔ跉[瘤細(xì)胞的同時(shí)，不同程度的損傷機(jī)體的正常組織和器官，影響化療進(jìn)程及藥物劑量的選擇。在提高白血病的治療效果并減輕其毒副反應(yīng)是當(dāng)前白血病治療的迫在解決的問題之一。

還原性谷胱甘肽(glutathi-one，GSH)是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的小分子三肽化合物，在拮抗氧化性毒物中發(fā)揮重要作用，一方面可與毒物分子及其代謝物發(fā)生結(jié)合反應(yīng)降低毒物毒性;另一方面可通過氧化還原反應(yīng)而降低毒物過氧化的能力，使含巰基酶免于被重金屬和氧化劑激活或使已氧化的含巰基酶還原而使其恢復(fù)活性。在自由基大量產(chǎn)生時(shí)，細(xì)胞膜不飽合脂肪酸氧化成脂過氧基，并引起一系列繼發(fā)損傷。GSH可直接通過供H+拮抗氧自由基毒性，終止連鎖反應(yīng)，其本身則被氧化成谷胱甘肽氧化型(oxidized glutathione，GSSG)。同樣，GSH在對(duì)抗氧自由基過氧化并抑制由此引發(fā)的細(xì)胞凋亡、壞死及自穩(wěn)態(tài)改變等方面亦發(fā)揮著重要作用［1］。

Chen等［2］認(rèn)為三價(jià)砷是巰基的絡(luò)合劑，與巰基有很強(qiáng)的親和力，且它與鄰近含巰基或二巰基功能基團(tuán)的蛋白質(zhì)的結(jié)合能力遠(yuǎn)高于含單巰基者，因此推測(cè)含二巰基基團(tuán)的蛋白質(zhì)可能是三氧化二砷作用的主要靶分子。研究證實(shí)，砷化物與-SH結(jié)合后可能通過多條途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，比如激活核因子κB使其表達(dá)增加，下調(diào)凋亡調(diào)控基因Bcl-2，上調(diào)抑癌基因p53等。此外，砷與-SH結(jié)合還直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的GSH耗竭，使活性氧產(chǎn)生增多，而活性氧已被證實(shí)是重要的細(xì)胞凋亡介質(zhì)。以上進(jìn)一步說明，三氧化二砷的凋亡效應(yīng)與細(xì)胞谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)密切相關(guān)，三氧化二砷的這一作用與其本身的性質(zhì)有關(guān)。

本組結(jié)果顯示，表明還原型谷胱甘肽可以拮抗三氧化二砷對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用。但調(diào)整給藥時(shí)間及順序，提前應(yīng)用還原型谷胱甘肽將增加三氧化二砷對(duì)HL-60細(xì)胞的促凋亡作用。因此，為臨床上合理用藥，降低化療副作用保護(hù)正常組織的同時(shí)而更好的殺傷腫瘤細(xì)胞提供理論支持。

［1］趙克然，楊毅軍，曹道俊.氧自由基與臨床.北京：中國(guó)醫(yī)學(xué)科技出版社，2000：47-56.

［2］張曉紅，蘇立達(dá)，呂慶華.三氧化二砷誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡過程中IJB-A、NF-JB蛋白表達(dá)的研究.實(shí)用腫瘤雜志，2004，19(4)：292-295.

136000 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)四平醫(yī)院血液科

王曉華