李 楊 江連洲 王勝男 李丹丹 齊寶坤 王 梅 劉 琪

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030)

(國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心2，哈爾濱 150030)

響應(yīng)面法優(yōu)化水酶法提取松子油的研究

李 楊1，2江連洲1，2王勝男1李丹丹1齊寶坤1王 梅1劉 琪1

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030)

(國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心2，哈爾濱 150030)

用Alcalase堿性蛋白酶對(duì)松子仁進(jìn)行水解，提取松子油，試驗(yàn)以總油提取率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)對(duì)酶解溫度，加酶量，料液比，酶解pH和酶解時(shí)間5個(gè)影響因素進(jìn)行了研究，并用響應(yīng)面法進(jìn)行了優(yōu)化。上述影響因素中，酶解溫度為主要的影響因素，其他依次為加酶量，料液比，酶解pH，酶解時(shí)間。本試驗(yàn)優(yōu)化后得到的最佳酶解條件為:加酶量1.97%，溫度51℃，時(shí)間3.0 h，料水比1∶5，pH 8.4，松子總油提取率可達(dá)89.12%。測(cè)定松子油的5種脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為，棕櫚酸3.89%，硬脂酸1.53%，油酸19.44%，亞油酸50.09%，亞麻酸 0.58%。

水酶法 堿性蛋白酶 松子油 響應(yīng)面 脂肪酸

紅松種仁為松科植物紅松(Pinus koraiensis)的去果皮種子。紅松種仁既含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維、碳水化合物等多種營(yíng)養(yǎng)成分，更含有α－亞麻酸等多種人體必需的多不飽和脂肪酸［1］。松子油取之于自然界紅松樹種子，是一種較為理想的綠色木本植物油脂，在自然界是天然大宗產(chǎn)品，取之不盡，有待人們開發(fā)利用。隨著追求天然食品潮流的興起，紅松種仁相關(guān)研究及產(chǎn)品開發(fā)逐漸成為功能性食品研究領(lǐng)域中的一個(gè)新亮點(diǎn)，其不但能增加食用油品種，調(diào)節(jié)人們食品營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，而且還能提高經(jīng)濟(jì)效益，因此松子油開發(fā)前景廣闊［2］。

目前，關(guān)于松子油研究開發(fā)的報(bào)道較少，特別是采用水酶法提取松子油更是罕見。水酶法提油技術(shù)簡(jiǎn)單，操作安全，效率高。比傳統(tǒng)的油脂提取方法相比，其所的得油質(zhì)量高，色澤淺，易于精煉，蛋白變性小，適于加工多種蛋白產(chǎn)品。此外水酶法提油還有生產(chǎn)過程能耗低，無揮發(fā)性有機(jī)物，污染少，易處理等優(yōu)點(diǎn)［3］。隨著酶制劑在食品工業(yè)中的普及和發(fā)展，植物油提取的酶處理工藝前景會(huì)越來越廣闊。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

脫皮紅松子仁:產(chǎn)自長(zhǎng)白山;Alcalase堿性蛋白酶(活力1.2×105U/mL):novo公司;其他均為分析純。

1.2 設(shè)備和試劑

HP6890/HP5973GC/MS聯(lián)用儀:美國(guó)惠普公司;LDZ5－2型臺(tái)式低速離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;FA2004型電子分析天平:上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;F2102型植物試樣粉碎機(jī):天津泰斯特儀器有限公司;XMTD－4000型電熱恒溫水浴鍋:北京市永光明醫(yī)療儀器廠;JJ－1型增力電動(dòng)攪拌機(jī):金壇市醫(yī)療器械廠;WGL－45B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分析檢測(cè)方法

水分的測(cè)定:參考GB 5009.3—2010;粗脂肪的測(cè)定:參考GB/T 14772—2008;粗蛋白的測(cè)定:參考GB 5009.5—2010;灰分測(cè)定:參考 GB/T 5505—2008。

1.2.2 松子油的酶法提取工藝

采用單因素試驗(yàn)加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、料水比和酶解pH共5個(gè)因素進(jìn)行研究，確定各因素的最佳水平值范圍，采用響應(yīng)面中心組和試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究各酶解參數(shù)對(duì)考察指標(biāo)的影響規(guī)律。選取加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、料水比和酶解pH共5個(gè)因素為自變量，以總油提取率為響應(yīng)值，優(yōu)化松子油提取工藝的最佳參數(shù)。

1.2.2.1 工藝流程

1.2.2.2 操作要點(diǎn)

稱取30 g經(jīng)粉碎的松子仁粉，按一定料液比加入蒸餾水，置于恒溫水浴鍋中并不斷的伴隨著攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)pH，加入一定量的Alcalase堿性蛋白酶，恒溫下酶解，一定時(shí)間后，升溫至100℃滅酶5 min，最后進(jìn)行離心分離，取出上層清油，殘?jiān)娓伞?/p>

松子總油提取率按此式計(jì)算:

1.2.3 松子油脂肪酸分析方法

1.2.3.1 松子仁脂肪酸甲酯的制備

吸取0.2 mL紅松種仁油，加入4 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉－甲醇溶液，在65℃水浴攪拌大約15 min，待油滴完全消失后，再加入3 mL三氟化硼－甲醇(20%，m/V)溶液，繼續(xù)反應(yīng)5 min，混合液加入10 mL石油醚和10 mL水，萃取兩次后合并石油醚層備用。

1.2.3.2 GC －MS 分析條件

色譜條件:色譜柱為HP－1(25 m×0.2 mm×0.33 μm)彈性石英毛細(xì)管柱;載氣為 He氣;載氣流量為1 mL/min;進(jìn)樣口溫度為230℃;起始柱溫60℃，保持10 min，以15℃/min升溫到200℃，保持2 min，再以5℃/min升溫至230℃，保持30 min，汽化室溫度為230℃，燈絲延遲450 s，分流比50∶1，進(jìn)樣量 0.2 μL。

質(zhì)譜條件:電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度200℃，質(zhì)譜掃描范圍30～500 a.m.u。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS9.2統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析［4］。

2 結(jié)果與討論

2.1 松子仁的主要成分

本試驗(yàn)用松子仁的主要成分如表1。

表1 松子仁的主要成分

2.2 Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶提取松子油的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 加酶量對(duì)提油率的影響

加酶量對(duì)提油率的影響如圖1。由圖1可知，在一定范圍內(nèi)，隨著加酶量的增加，提油率升高，當(dāng)加酶量到達(dá)2%時(shí)，提油率接近最大值，但超過2%時(shí)，提油率趨于穩(wěn)定。原因主要為酶量增加，酶與底物作用的越充分，酶滲透到脂質(zhì)體膜內(nèi)，以及酶對(duì)脂蛋白、脂多糖的分解作用，有利于油脂從復(fù)合體中釋放［5］。最佳的加酶量為2%。

圖1 加酶量對(duì)松子提油率的影響

2.2.2 酶解溫度對(duì)提油率的影響

酶解溫度對(duì)提油率的影響見圖2。如圖2所示，在低于50℃時(shí)，提油率隨著溫度的升高而增加，當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，提油率隨著溫度的升高而降低，因?yàn)榇撕鬁囟葘⒊^酶的最適溫度，酶活性降低，同時(shí)過高的溫度會(huì)使酶變性，部分或全部失去催化活性［6］，因此最適溫度為50℃。

圖2 酶解溫度對(duì)松子提油率的影響

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)提油率的影響

酶解時(shí)間對(duì)提油率的影響見圖3。如圖3所示，當(dāng)時(shí)間低于2.5 h時(shí)，提油率大幅上升，變化程度較明顯，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提油率變化程度不明顯。說明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，底物不斷減少，酶解充分，但時(shí)間過長(zhǎng)使油與空氣接觸長(zhǎng)，影響油的品質(zhì)。因此最適合的酶解時(shí)間為2.0 ～3.5 h。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)松子提油率的影響

2.2.4 料液比對(duì)提油率的影響

料液比對(duì)提油率的影響見圖4。如圖4可知，隨著料液比的降低或底物濃度的升高，總油提取率先升高而后緩慢下降，在1∶6時(shí)最高。水酶法提油過程中適量的水對(duì)酶解具有積極的意義，但水過量時(shí)，酶反應(yīng)體系中酶濃度和底物濃度低，使酶分子與底物分子碰撞的幾率降低，酶作用效果降低。水量過低，則料液黏度太大，影響了酶和底物的流動(dòng)，也降低了酶作用效果［7］。因此最適料液比為1∶6。

圖4 料液比對(duì)松子提油率的影響

2.2.5 pH 對(duì)提油率的影響

pH對(duì)提油率的影響見圖5。如圖5可知，隨著pH的增加，提油率逐漸增加，當(dāng)pH為9時(shí)，提油率最高，而后隨著pH的增加，提油率逐漸降低。主要的原因是試驗(yàn)用堿性蛋白酶的最適pH接近9，pH在9附近時(shí)，酶活高，酶對(duì)底物作用的效果明顯，油的提取率高。反之，提油率低［8］。因此最適的pH為9。

圖5 酶解pH對(duì)松子提油率的影響

2.3 Alcalase堿性蛋白酶提取松子油響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮經(jīng)濟(jì)效益及松子油品質(zhì)，確定各因素的最佳水平值范圍，采用響應(yīng)面中心組和試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究各酶解參數(shù)對(duì)考察指標(biāo)的影響規(guī)律，并得到酶解的最佳條件。以各酶解工藝參數(shù)加酶量(x1)、酶解溫度(x2)、酶解時(shí)間(x3)、料液比 (x4)、pH(x5)為自變量，以總油提取率響應(yīng)值，其因素水平編碼表見表2。響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。試驗(yàn)號(hào)1～26為析因試驗(yàn)，27～32為6個(gè)中心試驗(yàn)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表2 因素水平編碼表

表3 響應(yīng)方案及結(jié)果

2.4 Alcalase堿性蛋白酶提取松子油響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

通過統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS9.2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型如下:

回歸與方差分析結(jié)果見表4，降維分析見圖6，響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果見表5，交互項(xiàng)顯著的響應(yīng)面分析圖7。

表4 回歸與方差分析結(jié)果

進(jìn)一步對(duì)該回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，響應(yīng)曲面數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果見表4。由表4可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著(P＜0.001)，失擬項(xiàng)不顯著，并且該模型 R2=94.85%=85.48%，說明該模型與試驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，試驗(yàn)誤差小，可以用此模型來分析和預(yù)測(cè)水酶法提取松子油的結(jié)果。由此可以認(rèn)為上面給出的二次回歸方程模型是合適的。由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為:x2＞x1＞x4＞x3＞x5，即酶解溫度＞加酶量＞料液比＞酶解pH＞酶解時(shí)間。

由圖6可以看出各酶解參數(shù)對(duì)考察指標(biāo)總油提取率的影響規(guī)律，總油提取率隨加酶量的增加，先增加而后降低?？傆吞崛÷孰S酶解溫度變化也呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，這主要因?yàn)閴A性蛋白酶在接近最適溫度時(shí)酶解效果好。總油提取率隨酶解時(shí)間的增加而增加，但達(dá)到一定時(shí)間后總油提取率將下降?？傆吞崛÷孰S料液比的增加而增大，但達(dá)到一定值后繼續(xù)增加料液比會(huì)稀釋酶和底物濃度，降低了酶分子和底物分子之間的碰撞幾率，減弱了酶的作用效果，所以總油提取率減小。總油提取率隨值的酶解pH升高先升高后降低，但是范圍一直處在堿性范圍對(duì)酶活的影響比其他因素影響的程度較低。

圖6 各酶解參數(shù)對(duì)松子油提取率的降維分析

應(yīng)用響應(yīng)面尋優(yōu)分析方法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果見表5，由表5可知當(dāng)加酶量為1.97%，溫度為 51 ℃，酶解時(shí)間為 3.0 h，料水比為1∶5，pH 為8.4，響應(yīng)面最優(yōu)值為(89.75 ±1.01)%。

表5 響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果

由圖7分析結(jié)果可看出:加酶量(x1)與酶解pH(x5)、酶解溫度(x2)與酶解時(shí)間(x3)、以及料液比(x4)與酶解pH(x5)的交互作用對(duì)總油提取率的影響。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

在響應(yīng)面分析法求得的最佳條件下，即加酶量1.97%，溫度51 ℃，時(shí)間 3.0 h，料水比 1∶5，pH 8.4時(shí)進(jìn)行平行試驗(yàn)(3次)，3次平行試驗(yàn)的平均值為89.12%。響應(yīng)值的試驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測(cè)值吻合良好，說明該模型能夠較好地預(yù)測(cè)實(shí)際松子油提取率情況。

2.6 松子油脂肪酸分析

對(duì)紅松種仁油脂肪酸甲酯進(jìn)行了GC－MS分析，根據(jù)GC－MS聯(lián)用儀獲得質(zhì)譜信息經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照、分析了棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸5種主要組分，分別為對(duì)色譜圖進(jìn)行面積歸一化定量了各種脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明松子油的脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為棕櫚酸3.89%，硬脂酸 1.53%，油酸 19.44%，亞油酸50.09%，亞麻酸 0.58%。

3 結(jié)論

選用Alcalase堿性蛋白酶提取松子油，利用響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化得到水解最佳條件為加酶量1.97%，溫度 51 ℃，酶解時(shí)間 3.0 h，料水比 1∶5，pH 8.4，松子總油提取率為89.12%。由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為:x2＞x1＞x4＞x3＞x5，即酶解溫度＞加酶量＞料液比＞酶解pH值＞酶解時(shí)間。試驗(yàn)得到的松子油淡黃色，澄清透明，具有松子特有的香味。所測(cè)松子油的5種脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為，棕櫚酸3.89%，硬脂酸 1.53%，油酸 19.44%，亞油酸50.09%，亞麻酸 0.58%。

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Optimization on Aqueous Enzymatic Extraction Conditions of Pine Seed Oil by Response Surface Method

Li Yang1，2Jiang Lianzhou1，2Wang Shengnan1Li Dandan1Qi Baokun1Wang Mei1Liu Qi1
(Northeast Agricultural University，College of Food Science1，Harbin 150030)
(The National Research Center of Soybean Engineering and Technology2，Harbin 150030)

Pine seed oil was extracted from pine seed by the aqueous enzymatic method use Alcalase.Based on a single experiment，the effects of different enzyme amount，ratio of solid to liquid，pH and hydrolysis time on total extraction rate of pine seed oil was studied.Then，response surface method was applied to optimize the extraction conditions of pine seed oil.The above factors，the hydrolysis temperature is the main factor，followed by the enzyme amount，ratio of solid to liquid，pH and hydrolysis time.The results showed that optimum conditions were:enzyme amount1.97%，hydrolysis temperature 51 ℃，enzymolysis time 3.0 h，the ratio of solid to liquid 1∶5，pH 8.4.The total extraction rate of pine seed oil can reach 89.12%.The result shows that the content of fatty acid in hazelnut oil as follows，palmitic acid is3.89%，stearic acid 1.53%，oleic acid is 19.44%，linoleic acid is 50.09%，linolenic acid is 0.58%.

aqueous enzymatic extraction，alcalase，pine seed oil，response surface，fatty acid

TS224.8

A

1003－0174(2012)03－0060－06

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目(nycytx－004)，黑龍江省攻關(guān)項(xiàng)目(GA09B401－6)

2011－08－17

李楊，男，1981年出生，講師，糧食、油脂及植物蛋白工程

江連洲，男，1960年出生，教授，博士生導(dǎo)師，糧食、油脂及植物蛋白工程