曹慧玲 徐 冶 劉曉冬 于 洋 劉師兵 王曉軍 孫路陽 李玉璞

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

微波對腫瘤細(xì)胞的熱損傷已廣泛應(yīng)用，特別對中心型支氣管肺癌局部姑息治療有重要意義。熱效應(yīng)之外的非熱效應(yīng)對腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用日益引起重視，探討微波非熱效應(yīng)對腫瘤細(xì)胞的影響，對減少照射劑量、減輕局部副損傷有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料 IMDM培養(yǎng)基、新生牛血清購于Gibco公司;一抗購自美國Santa Cruz公司;二抗、DAB及Hoechst 33342熒光染料購于北京鼎國公司;A549細(xì)胞：由吉林大學(xué)贈送，用含10%新生牛血清的IMDM培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)培養(yǎng)，隔2～3 d傳代1次，取生長狀態(tài)良好對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。微波儀：南京匯研MY8C-1型微波功率源。流式細(xì)胞儀：EPICS XL，Beckman。共聚焦顯微鏡：Olympus FV1000。

1.2 方法 將A549細(xì)胞分為空白對照組、低照射劑量組(100 W，照射強(qiáng)度12 mV/cm2)、中照射劑量組(150 W，照射強(qiáng)度18 mV/cm2)和高照射劑量組(200 W，照射強(qiáng)度為21 mV/cm2)，每組均在冰浴條件下〔1〕照射10 min。照射后24 h光鏡下觀察照相、收集細(xì)胞。

1.2.1 Western印跡法檢測蛋白表達(dá) 待細(xì)胞生長到對數(shù)生長期時，離心收集細(xì)胞，每瓶加入120 μl細(xì)胞蛋白裂解液RIPA，混勻，細(xì)胞粉碎儀超聲細(xì)胞2次，充分裂解細(xì)胞，離心收集上清，采用Bio-Rad法測定蛋白含量。SDS-PAGE電泳分離蛋白利用濕轉(zhuǎn)法將分離膠上蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，用5%脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗3次，加入相應(yīng)一抗(1∶200稀釋)4℃過夜。第二天，PBST洗3次，加入過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶1 000稀釋)，搖床搖1 h;PBST洗3遍。DAB顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照;同時以β-actin作為內(nèi)參照。

1.2.2 Rh123染色檢測細(xì)胞凋亡 消化并收集細(xì)胞，PBS洗2次，取2×106個細(xì)胞，加 Rh123染液5 μg/ml，37℃避光孵育30 min，PBS洗2次，重懸于500 μl PBS中，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 間接免疫熒光、Hoechst 33342染色檢測細(xì)胞凋亡 取細(xì)胞密度1×105/ml置于24孔板中，每孔500 μl接種過夜。爬片固定后經(jīng)0.1%Triton-PBS作用5 min，非免疫山羊血清封閉30 min，加入一抗4℃過夜;洗滌后加入熒光二抗30 min，洗滌后抗熒光淬滅劑封片。Hoechst 33342染色法省去一抗和二抗孵育步驟，直接加入Hoechst 33342染色液室溫15 min，洗滌后抗熒光淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量微波照射A549細(xì)胞后光鏡下形態(tài)變化 與對照組相比，照射劑量越大細(xì)胞數(shù)減少越明顯，細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞質(zhì)越致密。見圖1。

2.2 不同劑量微波照射A549細(xì)胞后流式分析凋亡結(jié)果 隨著微波照射強(qiáng)度的增加，A549細(xì)胞結(jié)合Rh123的能力下降，高熒光密度群百分率減少、平均熒光密度下降、低熒光密度群百分率增加(2.9%vs 5.4%、7.6%、9.9%;P＜0.01)。見圖2。

2.3 不同劑量微波照射A549細(xì)胞后Hoechst 33342與間接免疫熒光染色共聚焦檢測凋亡結(jié)果 微波照射A549細(xì)胞后，間接免疫熒光法檢測到細(xì)胞凋亡蛋白caspase3活化增多，熒光強(qiáng)度隨劑量的增加而增強(qiáng)。A549細(xì)胞被微波照射后，藍(lán)色熒光強(qiáng)度隨著照射劑量的增大而增高，核碎裂細(xì)胞增多。見圖3，圖4。

2.4 不同劑量微波照射后Western印跡檢測凋亡蛋白變化

各照射組Bax/Bcl-2均高于對照組(P＜0.01)，照射劑量越大該比值越高;各照射組Caspase3均高于對照組(P＜0.01)，照射劑量越大，該值越高。見圖5，圖6。

圖1 微波作用A549細(xì)胞光鏡變化(×200)

圖2 微波作用A549細(xì)胞后Rh123染色流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電勢變化

圖3 Hoechst 3342染色共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡

圖4 間接免疫熒光法共聚焦顯微鏡檢測活性caspase3

圖5 微波作用A549細(xì)胞后凋亡蛋白表達(dá)變化

圖6 Western印跡結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

微波在醫(yī)療方面有著廣泛的應(yīng)用。高強(qiáng)度微波主要顯現(xiàn)的是熱效應(yīng)，而低強(qiáng)度產(chǎn)生的非熱效應(yīng)對生物體的影響和作用機(jī)制均不明確〔2〕。與正常細(xì)胞比較，腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)是凋亡減少、增殖旺盛。已有資料表明：暴露于非熱的微波中可誘發(fā)人上皮癌KB細(xì)胞凋亡且呈時間依賴性〔3〕。因此，關(guān)注微波非熱效應(yīng)是否能誘導(dǎo)人肺癌A549腫瘤細(xì)胞凋亡及其機(jī)制，探索低強(qiáng)度微波在生物治療領(lǐng)域的應(yīng)用價值顯得尤為重要。

有實(shí)驗(yàn)用加熱處理擯除微波熱效應(yīng)的影響，強(qiáng)烈提示微波對微生物存在著明顯的非熱效應(yīng)〔4〕。本實(shí)驗(yàn)采用的是在冰浴摒除熱效應(yīng)條件下，不同劑量微波照射10 min后24 h光鏡觀察：結(jié)果顯示，隨著照射劑量增大，細(xì)胞數(shù)減少明顯，細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞核輪廓不清，細(xì)胞質(zhì)致密，符合凋亡前細(xì)胞的非特異性變化。在微波輻射誘導(dǎo)下定位于線粒體的Bcl-2表達(dá)下降、Bax表達(dá)上升，定位于胞質(zhì)的Caspase3增加，此過程促進(jìn)了線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。線粒體是真核細(xì)胞的重要細(xì)胞器，是動物細(xì)胞生成ATP的主要地點(diǎn)。線粒體跨膜電位的耗散與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。微波能夠影響膜的通透性及膜電位，導(dǎo)致電穿孔〔5〕。隨著照射強(qiáng)度的增加，A549細(xì)胞膜電位發(fā)生了變化，使其結(jié)合Rh123的能力明顯下降，表現(xiàn)為Rh123染色顯示低熒光密度群百分率顯著增加;凋亡細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，使Hoechst 33342能較多地進(jìn)入其中，同時凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷，不能有效地將Hoechst 33342排出到細(xì)胞外，使之在細(xì)胞內(nèi)積累，表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度增高。

本實(shí)驗(yàn)表明微波的非熱效應(yīng)對人A549細(xì)胞有明顯的促凋亡作用。微波非熱作用除促進(jìn)細(xì)胞凋亡外，還通過改變離子通道、誘發(fā)氧自由基等途徑〔6〕破壞腫瘤細(xì)胞。這些作用尚需更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明。

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3 Caraglia M，Marra M，Mancinelli F，et al.Electromagnetic fields at mobile phone frequency induce apoptosis and inactivation of the multi-chaperone complex in human epidermoid cancer cells〔J〕.J Cell Physiol，2005;204(2)：539-48.

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5 盧恩勇，徐向民，賴聲禮.微波的生物效應(yīng)及研究進(jìn)展〔J〕.廣州醫(yī)藥，2005;36(1)：4-7.

6 楊少華.2450MHz微波生物學(xué)效應(yīng)的研究進(jìn)展〔J〕.華夏醫(yī)學(xué)，2006;19(1)：172-4.