張艷平 (常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，湖南 常德 415000)

BHRF1基因是凋亡抑制基因，其編碼的蛋白能通過多種途徑抑制細胞凋亡的發(fā)生，最終導(dǎo)致細胞癌變。BHRF1蛋白與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有很大關(guān)系，這對鼻咽癌的診斷、治療和預(yù)后具有重要意義?；蜉d體的選擇與構(gòu)建合適的載體系統(tǒng)是基因治療的關(guān)鍵之一〔1〕。慢病毒(LV)不僅具有可感染分裂細胞及非分裂細胞、轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點，還進一步提高了基因表達的安全性〔2，3〕。本研究中構(gòu)建BHRF1表達載體，以期在真核細胞中高效、穩(wěn)定表達，從而為進一步從分子水平探討B(tài)HRF1分子機制奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及細胞 大腸桿菌TOP10購于華美生物工程公司;LV包裝體系pWPXL Lentivector Packaging Kit(質(zhì)粒pWPXL-IRES-GFP、包裝質(zhì)粒HELPER和包膜質(zhì)粒VSVG)購自美國System Biosciences公司;293T細胞購自中國科學(xué)院典藏細胞委員會細胞庫。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoR I、Mlu I，T4連接酶及DNA聚合酶購于TaKaRa公司;Trizol total RNA試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒、質(zhì)粒小抽試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒等分別購于Axrgen公司和TOYOBO公司;Lipofectamine2000購于Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基及小牛血清購于Hyclone公司;主要試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 BHRF1基因的一對擴增引物如下：BHRF1-前向：5'-GGAATTCTTACATGGCGCTAACCTCCATC-3'，BHRF1-反向：5'-CGGGATCCTGCTGTCAACTCCAACACAGGATGCAAAC C-3'。上游引物均從5'開始，添加了EcoR I酶切位點(GAATTC)，下游引物均從 5'開始，添加了 BarnH I酶切位點(GGATCC)。引物由北京鼎國公司合成。

1.2.2 BHRF1基因RT-PCR擴增 將收集保存于液氮中的鼻咽癌組織標本取出后迅速放入干冰中，在樣品冰凍的狀態(tài)下，切取、稱量1 mg，添加1 ml 4℃預(yù)冷的Trizol，在冰上進行組織研磨，參照Trizol total RNA試劑盒說明書，采用一步法提取鼻咽癌組織中的總RNA后再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以BHRF1基因cDNA為模板，進行PCR擴增。擴增體系：10×緩沖液 5 μl，MgSO4(50 mmol/L)2 μl，Template(plasmid DNA)1 μl，Taq HiFi(5 U/μl，Invitrogen)0.2 μl，上、下游引物(10 μmol/L)1 μl、dNTP(10 mmol/L)1 μl，加 ddH2O 至 50 μl。PCR 循環(huán)反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 3 min;94℃ 30 s，56℃ 1 min，68℃ 1 min 10 s，共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定。

1.2.3 BHRF1基因的LV表達載體的構(gòu)建 回收純化PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Mlu I分別雙酶切PCR產(chǎn)物與LV表達載體，T4 DNA連接酶將回收純化的PCR產(chǎn)物連接于線性化的LV表達載體中。連接體系為：10×T4連接酶緩沖液1 μl，T4 連接酶 1 μl，目的片段 2 μl，pWPXL-IRES-GFP 病毒 1 μl，補ddH20至10 μl，16℃連接過夜。將5 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細胞，37℃ 250/min振蕩培養(yǎng)45 min。收集菌液，取200 μl涂布于LB平皿中，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單個菌落，限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。陽性克隆送上海生工技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 LV顆粒的制備 培養(yǎng)293T細胞，并于感染前1 d接種到直徑10 cm的培養(yǎng)皿，采用磷酸鈣沉淀法將LV載體三質(zhì)粒細胞包裝系統(tǒng)(表達質(zhì)粒pWPXL-hBHRF1-IRES-GFP、包裝質(zhì)粒HELPER和包膜質(zhì)粒VSVG)共轉(zhuǎn)染293T細胞。轉(zhuǎn)染后24 h，用含1%小牛血清白蛋白(FBS)的DMEM換液轉(zhuǎn)染48 h后，收集病毒上清，4℃下50 000 r/min離心2.5 h沉淀病毒顆粒，棄上清，1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸病毒，10 μl/EP管進行分裝，－70℃保存。

1.2.5 LV滴度的測定 293T細胞用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d以2×105/孔接種入6孔板中，孵箱中培養(yǎng)至細胞50%融合。棄去細胞培養(yǎng)液，按階梯稀釋法將LV液稀釋10－1～10－5共5個濃度(終體積1 ml)，分別加至6孔板中。病毒滴度測定：72 h后熒光顯微鏡下計數(shù)綠色熒光蛋白(GFP)陽性細胞數(shù)以計算病毒滴度(病毒滴度=GFP陽性細胞率×細胞總數(shù)/LV液體積×LV液稀釋倍數(shù))(TU/ml)。取各組平均值計算滴度。

2 結(jié)果

2.1 BHRF1 cDNA的鑒定結(jié)果 以BHRF1 cDNA為模板進行PCR擴增，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定PCR產(chǎn)物：電泳圖中可見PCR擴增的780 bp大小的目的片段，初步判定PCR擴增出BHRF1全編碼序列。DNA測序結(jié)果顯示目的基因擴增正確，無堿基突變及缺失。見圖1。

圖1 RT-PCR結(jié)果

圖2 重組慢病毒鑒定結(jié)果

2.2 重組LV表達載體pWPXL-hBHRF1-IRES-GFP的構(gòu)建及鑒定 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行菌落PCR，限制性內(nèi)切酶Mul I及EcoR I對PCR產(chǎn)物進行雙酶切鑒定結(jié)果：可見780 bp大小的目的條帶和LV表達載體載體pWPXL-IRES-GFP片段，說明Atoh1已經(jīng)重組于pWPXL-IRESGFP vertor內(nèi)，再次測序結(jié)果表明目的基因插入方向和序列完全正確，證明重組LV表達載體構(gòu)建成功。見圖2。

2.3 LV載體系統(tǒng)的鑒定 取病毒上清感染293T細胞24 h后，熒光顯微鏡下可觀察到大量GFP表達，熒光蛋白表達效率達90%，確定病毒滴度為1.0×108ifμ/ml。提示重組LV在體外培養(yǎng)條件下能使真核細胞顯著表達外源基因。見圖3。

圖3 慢病毒上清感染293T細胞后24 h熒光檢測(×100)

3 討論

BHRF1基因所編碼的BHRF1蛋白分子A鏈 (類型為多肽)，長度為173，BHR F1蛋白分子 B鏈片段長度從1～160。Bcl-2基因?qū)儆诩毎蛲鲆蜃?，也是細胞存活促進因子，屬膜整合蛋白，分子量為26 kD，定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和連續(xù)的核周膜。BHRF1基因所編碼的BHRF1蛋白與Bcl-2基因所編碼的Bcl-2蛋白有很高的同源性，其功能也有很高的相似性〔4〕。有研究顯示bcl-2基因與鼻咽癌尤其是晚期癌細胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，同時還提示bcl-2基因表達有促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用〔5〕。然而BHRF1基因是否參與了鼻咽鱗癌細胞凋亡調(diào)節(jié)，需要進一步研究證實。

基因載體的選擇與構(gòu)建合適的載體系統(tǒng)是基因治療的關(guān)鍵之一。目前在以基因治療為目的的載體系統(tǒng)中，病毒載體顯得格外令人關(guān)注〔6〕。本課題所選用的LV不僅具有可感染分裂細胞及非分裂細胞、目的基因表達時間長、轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點，還進一步提高了基因表達的安全性〔7〕。不僅克服了以往逆轉(zhuǎn)錄病毒表達沉默的缺陷，而且轉(zhuǎn)基因的效率遠遠高于傳統(tǒng)的顯微注射法，是轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域的突破性進展。

為了更進一步探索BHRF1基因?qū)υ诒茄拾┑淖饔脵C制及生物活性，本實驗正確擴增出BHRF1基因全長編碼序列，并成功構(gòu)建帶有熒光標記的LV表達載體。包裝后的LV轉(zhuǎn)染293T細胞，顯微熒光靜下觀察到熒光蛋白表達，轉(zhuǎn)染效率達90%，表明所構(gòu)建LV顆?？筛咝мD(zhuǎn)染真核細胞，這為進一步研究BHRF1基因的相關(guān)功能提供了適合的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體。

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