張 婷 王紅梅 李 強(qiáng) 孫曉江 (上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200233)

自噬是細(xì)胞對(duì)于環(huán)境變化的有效反應(yīng)，維持細(xì)胞代謝的轉(zhuǎn)換及動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)新陳代謝起著舉足輕重的作用，可以作為一種防御機(jī)制清除胞質(zhì)內(nèi)受損的細(xì)胞器、代謝產(chǎn)物及病原體，進(jìn)行亞細(xì)胞水平上的重構(gòu)，保護(hù)受損的細(xì)胞。然而，自噬過(guò)度激活可以誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，稱(chēng)為Ⅱ型程序性細(xì)胞凋亡，從而引起一系列的疾病〔1，2〕。一些觀點(diǎn)認(rèn)為在缺血早期，腦內(nèi)自噬途徑過(guò)度激活是有害的〔3〕，但有的觀點(diǎn)認(rèn)為這是機(jī)體的潛在保護(hù)機(jī)制〔4〕。本文采用實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型，觀察DM小鼠短暫性腦缺血引起的腦內(nèi)自噬活性的改變。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇C57BL/6小鼠及沙士鼠。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)性DM小鼠模型 在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為四組：假手術(shù)(Sham)組、腦缺血(VO)組，DM-假手術(shù)(DMSham)組和 DM-腦缺血(DM-VO)組。參照 Zhang等方法〔5〕，以腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)DM模型動(dòng)物;同齡正常對(duì)照小鼠腹腔注射空白對(duì)照溶液(檸檬酸緩沖液，pH4.2)。STZ注射4 w后，小鼠尾端采血，Roch血糖儀及試紙檢測(cè)血糖，以空腹血糖＞8.0 mmol/L作為DM誘導(dǎo)成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。選擇符合條件的DM小鼠進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 短暫性腦缺血模型的制作 C57BL/6小鼠及沙土鼠缺乏后交通動(dòng)脈及完整的基底動(dòng)脈環(huán)，兩側(cè)大腦供血相對(duì)獨(dú)立，通過(guò)閉塞一側(cè)或雙側(cè)頸動(dòng)脈即可復(fù)制效果明顯的同側(cè)或雙側(cè)腦缺血模型〔6〕，所以雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉(CCAO)術(shù)被廣泛用于中風(fēng)病理機(jī)制研究。術(shù)前2 h禁食，自由飲水。以10%水合氯醛麻醉成功后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部皮膚剪毛備皮，碘酒酒精消毒，以無(wú)菌器械沿頸部正中切開(kāi)皮膚及皮下組織，暴露頸部肌肉后，在一側(cè)頸前肌肉和側(cè)方肌肉間隙鈍性分離該側(cè)頸總動(dòng)脈，并避免損傷伴隨頸總動(dòng)脈行走的迷走神經(jīng)，以同樣方法分離對(duì)側(cè)頸總動(dòng)脈，以2個(gè)小號(hào)外科血管夾分別夾畢雙側(cè)頸總動(dòng)脈。雙側(cè)頸總動(dòng)脈同時(shí)夾畢30 min后，松開(kāi)血管夾，使血流再通，傷口內(nèi)撒入少許青霉素，間斷縫合皮膚，縫合完畢后酒精消毒傷口。術(shù)后送回籠中飼養(yǎng)。

1.2.3 透射電鏡 取分離腦組織用震動(dòng)切片機(jī)切成超薄切片(100 nm)，參照文獻(xiàn)〔7〕進(jìn)行后續(xù)處理。采用JEOL JEM-1230透射電鏡(JEOL，Japan)進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均采用s表示，多組間比較采用單因素方差分析，用LSD法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血糖水平比較 STZ處理后4 w，與非DM小鼠〔Sham 組(6.4±0.3)mmol/L〕，VO組(5.6±0.5)mmol/L，n=8)〕比較，DM小鼠血糖水平顯著升高〔(DM-Sham組(17±1.4)mmol/L，DM-VO 組(14.2 ± 1.2)mmol/L，n=8，P＜0.05〕。更重要的是，STZ治療4 w后，與非DM小鼠對(duì)比，DM小鼠表現(xiàn)出多飲、多尿、多食和體重下降。

2.2 電鏡檢查自噬體形態(tài) Sham組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線(xiàn)粒體和突觸等細(xì)胞器形態(tài)正常，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)囊泡樣小體(V)、自噬溶酶體(al)、環(huán)形多層膜結(jié)構(gòu)(avm)以及自噬囊泡樣電子致密物(avd)表達(dá)很少。而DM-VO組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)V、al、avm以及avd表達(dá)顯著增高。見(jiàn)圖1。

圖1 DM腦缺血實(shí)驗(yàn)小鼠腦內(nèi)自噬體的表達(dá)

2.3 各組自噬活性標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ表達(dá)水平 通過(guò)免疫印跡方法檢測(cè)CCAO后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在1 d、2 d、3 d及1 w時(shí)腦內(nèi)LC3-Ⅱ的表達(dá)水平，與Sham組相比，缺血后LC3-Ⅱ表達(dá)增高，持續(xù)至少3 d。與Sham組比較，VO組在1 d(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比率：皮層9.5±1.0，海馬11.1±1.6，n=4)表達(dá)接近高峰，DM-Sham組(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值：皮層1.4 ±0.1，海馬3.8 ±1.0，n=5)LC3-Ⅱ表達(dá)增高，DM-VO組(術(shù)后1 d時(shí)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值：皮層3.1±0.5，海馬1.3±0.1，n=4)較VO組LC3-Ⅱ表達(dá)顯著增高(P＜0.05)。

3 討論

近年來(lái)自噬受到科學(xué)界的重視，2004年《科學(xué)》雜志曾對(duì)2005年科技領(lǐng)域?qū)⒁l(fā)生的六件大事進(jìn)行了預(yù)測(cè)，自噬作用研究位列第一。隨著近年來(lái)對(duì)自噬機(jī)制的深入研究，已經(jīng)驗(yàn)證了《科學(xué)》雜志當(dāng)年的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其與很多疾病有密切的聯(lián)系，諸如神經(jīng)退行性病變、腫瘤、心肌病、病原微生物侵入感染以及老化等。自噬-溶酶體途徑是真核細(xì)胞對(duì)于外界環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化的一種適應(yīng)性機(jī)制。細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)貧乏的情況下，自噬途徑被激活，從而代謝出一些基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在細(xì)胞老化過(guò)程中，不斷產(chǎn)生有錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、有害的代謝產(chǎn)物或是老化的細(xì)胞器如線(xiàn)粒體等。在病理生理情況下，自噬溶酶體途徑調(diào)控短壽命和長(zhǎng)壽命蛋白、細(xì)胞器降解，從而保證蛋白質(zhì)正常工作，維持細(xì)胞的正常功能和生存，改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為學(xué)表現(xiàn)〔8〕。而電鏡檢查自噬體形態(tài)是檢驗(yàn)自噬活性的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究中，通過(guò)電鏡和免疫印跡方法發(fā)現(xiàn)，DM-VO組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)V、al、avm以及avd表達(dá)增高最為顯著。自噬活性與應(yīng)激相關(guān)，提示腦缺血(尤其是DM腦缺血)后腦內(nèi)應(yīng)激水平增高。

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