馬 博 鄭建忠 (新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院普外科，新疆 烏魯木齊 830002)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，目前大部分的胃癌確診病例已處于中晚期，很多治療結(jié)果不盡如人意。胃癌常有多種miRNA的表達(dá)異常，尋找腫瘤特異性的miRNA對(duì)于胃癌的診斷和治療有著重要的意義〔1，2〕。已有研究顯示microRNA-146a(miR-146a)+60位點(diǎn)處存在C→G基因多態(tài)性位點(diǎn)(rs2910164)，該多態(tài)性位點(diǎn)存在于其種子序列中，因而可能調(diào)控其成熟體，即miR-146a的表達(dá)水平〔3〕。另有研究顯示該位點(diǎn)與胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關(guān)，但miR-146a基因多態(tài)性及miR-146a表達(dá)量與胃癌關(guān)系尚無報(bào)導(dǎo)〔4〕。本研究探討 pre-miR-146a rs2910164基因多態(tài)性與胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的關(guān)系;同時(shí)，進(jìn)一步探討胃癌組織中miR-146a表達(dá)量的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究設(shè)計(jì)和標(biāo)本獲取 收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2008年10月至2012年03月手術(shù)切除胃癌標(biāo)本86例，另取年齡和性別匹配的活檢正常胃黏膜42例作正常對(duì)照。

1.1.2 試劑 蛋白酶K購(gòu)自默克公司;RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Takara公司;反轉(zhuǎn)錄試劑、miR-146a實(shí)時(shí)熒光定量試劑及內(nèi)參(U6)引物均購(gòu)自Applied Biosystems(ABI)公司;余試劑及緩沖液等為本實(shí)驗(yàn)中心儲(chǔ)存。

1.2 方法

1.2.1 基因組抽提、PCR及產(chǎn)物測(cè)序 使用蛋白酶K于56℃水浴消化10 mg胃癌組織后使用酚氯仿法抽提和純化基因組DNA。因miR-146a PCR產(chǎn)物過短，難以分離回收，按文獻(xiàn)方法擴(kuò)增其上下游序列，其中包含了miR-146a全長(zhǎng)〔5〕。PCR擴(kuò)增引物如下：上游引物：5'-ATTTTACAGGGCTGGGACAG-3';下游引物：5'-TCTTCCAAGCTCTTCAGCAG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度：227 bp。將PCR產(chǎn)物電泳、切膠回收后送Invitrogen公司測(cè)序，測(cè)序引物為PCR擴(kuò)增體系的上游引物。

1.2.2 miR-146a表達(dá)測(cè)定 使用real-time PCR方法測(cè)定miR-146a在組織中的表達(dá)：①將組織在Trizol中低溫勻漿，后使用氯仿抽提總RNA;再使用ABI公司miR-146a試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄〔6〕。②使用上述miR-146a試劑盒進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增;以2-△△CT法分析數(shù)據(jù)。使用U6作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SDPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，描述正態(tài)分布數(shù)據(jù)以s表示，以頻數(shù)和百分?jǐn)?shù)描述計(jì)數(shù)資料，使用基于Pearson χ2檢驗(yàn)的方法判斷對(duì)照組人群是否符合Hardy-Weinberg平衡定律;計(jì)數(shù)資料比較使用Pearson χ2檢驗(yàn);miR-146a在各種基因型表達(dá)差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法校正，胃癌患者癌組織與其自身正常組織miR-146a表達(dá)量差異使用配對(duì)t-檢驗(yàn);miR-146a表達(dá)量在轉(zhuǎn)移與否的胃癌患者癌組織中的差異比較采用成組t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 納入人群臨床特征 兩組患者年齡、性別等基線資料比較，差異無顯著性，具有可比性;肝腎功能等在兩組中存在顯著性差異。Hardy-Weinberg平衡定律顯示對(duì)照組基因型分布符合Hardy-Weinberg定律(P=0.78)。見表1。

2.2 胃癌患者與正常對(duì)照miR-146a基因型分布差異 miR-146a基因型分布在胃癌組和對(duì)照組中存在差異，表現(xiàn)為GG及GC基因型比例高而胃癌基因型比例低;χ2檢驗(yàn)顯示該差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)。以胃癌患者或正常對(duì)照為因變量，以年齡、性別、肝腎功能、吸煙狀況及基因型為自變量進(jìn)行Lo-gistic回歸分析，結(jié)果顯示GG及GC基因型是胃癌的危險(xiǎn)因素之一(GG 基因型：OR=1.26，95%CI：1.06 ～1.46;P ＜0.01;GC基因型，OR=1.15，95%CI：1.03 ～1.27;P=0.02)，即攜帶 GG基因型使胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加26%，而GC基因型攜帶者胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加15%。

按有無轉(zhuǎn)移將結(jié)腸癌患者分為兩組，分別設(shè)為T1轉(zhuǎn)移組(n=26)及T0無轉(zhuǎn)移組(n=60)。轉(zhuǎn)移組患者GG基因型比例顯著高于無轉(zhuǎn)移組，GC基因型比例亦略高于無轉(zhuǎn)移組。χ2檢驗(yàn)顯示兩組基因型分布存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Logistic回歸分析顯示攜帶GG基因使轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加60.5%(OR=1.61，95%CI：1.00～1.76;P ＜0.042);攜帶GC基因型并不增加轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.08，95%CI：0.88 ～1.25，P=0.58)。見表2。

為進(jìn)一步探討miR-146a基因多態(tài)性是否與其成熟體miR-146a表達(dá)量有關(guān)，使用real-time PCR方法檢測(cè)并比較了對(duì)照組中不同基因型中miR-146a表達(dá)量差異。GG和GC基因型人群miR-146a表達(dá)量均低于胃癌基因型，而GG與GC基因型攜帶者miR-146a表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明miR-146a基因多態(tài)位點(diǎn)中的G等位基因可能是顯性基因，介導(dǎo)miR-146a負(fù)性調(diào)節(jié)。

表1 納入人群臨床特征(s)

表1 納入人群臨床特征(s)

項(xiàng)目 胃癌組(n=86)對(duì)照組(n=42)P值60.20±12.18 62.16±10.64 0.38男/女(n)40/46 23/19 1.20吸煙〔n(%)〕 25(29.1)12(28.6)0.73肝功能谷丙轉(zhuǎn)氨酶(U/L)106.39±34.58 20.13±3.64 ＜0.01谷草轉(zhuǎn)氨酶(U/L)99.21±60.05 15.46±4.06 ＜0.01血肌酐(μmol/L)168.20±36.22 42.68±9.43 ＜0.01基因型分布〔n(%)〕GG 20(23.3)6(14.3)0.03 GC 44(51.2)19(43.2)胃癌〔n(%)〕 14(16.3)14(33.3)年齡(歲)

表2 胃癌轉(zhuǎn)移與否人群基本特征

2.3 miR-146a在胃癌患者中的表達(dá) 上述結(jié)果證明GG基因型與胃癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移有關(guān)，且G等位基因與miR-146a表達(dá)減少有關(guān)，為進(jìn)一步探討miR-146a表達(dá)量在胃癌組織中是否降低，使用real-time PCR方法檢測(cè)并比較miR-146a在胃癌組織及胃癌患者正常組織的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與患者自身正常胃黏膜組織比較，胃癌組織miR-146a表達(dá)量減少。且轉(zhuǎn)移組患者miR-146a表達(dá)進(jìn)一步減少，表明miR-146a與胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。

3 討論

早有實(shí)驗(yàn)報(bào)道m(xù)iR-146a在甲狀腺腫瘤、胰腺腫瘤及胃癌中可能發(fā)揮作用，本研究主要觀察miR-146a基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病相關(guān);進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-146a基因多態(tài)性與miR-146a表達(dá)量相關(guān)，而后者在胃癌患者表達(dá)量升高。這些研究結(jié)果提示miR-146a基因多態(tài)性及miR-146a表達(dá)量在胃癌發(fā)生發(fā)展起作用。

miR-146a多態(tài)性除與癌癥發(fā)生有關(guān)外，似乎與轉(zhuǎn)移關(guān)系更為密切。已經(jīng)證明的miR-146a的靶基因主要有兩個(gè)：表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)及白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶1(IRAK1)〔8〕。這兩個(gè)蛋白質(zhì)作用機(jī)制相對(duì)獨(dú)立，但均系影響腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要蛋白。EGFR作為miR-146a靶基因，已被證明在胃癌組織中得到上調(diào)〔9〕，支持本研究結(jié)果。EGFR在結(jié)構(gòu)及功能上與某些癌基因頗為相似，如通過EGF-EGFR-Raf-ERK信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖;EGFR受激動(dòng)時(shí)還可直接激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)，從而激活 NF-κB信號(hào)通路，而后者在惡性腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移中已得到充分論證。同時(shí)，已有研究顯示EGFR可通過ERK及p38信號(hào)通路直接調(diào)節(jié)金屬基質(zhì)蛋白酶9活性，而后者作為腫瘤轉(zhuǎn)移的重要物質(zhì)亦基本得到公認(rèn)〔10，11〕。相對(duì)于EGFR，IRAK1作用機(jī)制相對(duì)簡(jiǎn)單，IRAK1是NF-κB上游蛋白，可直接激活 NF-κB，從而參與調(diào)節(jié)胃癌發(fā)生發(fā)展〔12〕。因此，結(jié)合已有研究結(jié)果及本研究結(jié)論，支持miR-146a基因多態(tài)性→miR-146a表達(dá)量→EGFR及IRAK1表達(dá)量這一途徑在胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移中起重要作用。

本研究存在一定缺陷，如實(shí)驗(yàn)主要是病例對(duì)照研究，缺乏長(zhǎng)期隨訪，因而實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能需要前瞻性隊(duì)列研究來提供更多信息。另外，本研究樣本量相對(duì)較小，可能會(huì)使研究結(jié)論受到隨機(jī)誤差的影響。但實(shí)驗(yàn)揭示了miR-146a基因多態(tài)性與胃癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移的關(guān)系，同時(shí)提示miR-146a基因多態(tài)性對(duì)胃癌的影響可能是通過miR-146a基因多態(tài)性→miR-146a表達(dá)量→EGFR及IRAK1表達(dá)量這一途徑實(shí)現(xiàn)的〔13〕。隨著研究的深入和技術(shù)的進(jìn)步，相信miRNA在胃癌的發(fā)生機(jī)制上將取得突破性進(jìn)展，從而為胃癌的診斷、靶基因治療和預(yù)后預(yù)測(cè)等提供新的方法和依據(jù)。

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