馬 博 鄭建忠 (新疆醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院普外科，新疆 烏魯木齊 830002)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，目前大部分的胃癌確診病例已處于中晚期，很多治療結(jié)果不盡如人意。胃癌常有多種miRNA的表達異常，尋找腫瘤特異性的miRNA對于胃癌的診斷和治療有著重要的意義〔1，2〕。已有研究顯示microRNA-146a(miR-146a)+60位點處存在C→G基因多態(tài)性位點(rs2910164)，該多態(tài)性位點存在于其種子序列中，因而可能調(diào)控其成熟體，即miR-146a的表達水平〔3〕。另有研究顯示該位點與胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關，但miR-146a基因多態(tài)性及miR-146a表達量與胃癌關系尚無報導〔4〕。本研究探討 pre-miR-146a rs2910164基因多態(tài)性與胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的關系;同時，進一步探討胃癌組織中miR-146a表達量的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究設計和標本獲取 收集廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2008年10月至2012年03月手術切除胃癌標本86例，另取年齡和性別匹配的活檢正常胃黏膜42例作正常對照。

1.1.2 試劑 蛋白酶K購自默克公司;RNA提取試劑Trizol購自Takara公司;反轉(zhuǎn)錄試劑、miR-146a實時熒光定量試劑及內(nèi)參(U6)引物均購自Applied Biosystems(ABI)公司;余試劑及緩沖液等為本實驗中心儲存。

1.2 方法

1.2.1 基因組抽提、PCR及產(chǎn)物測序 使用蛋白酶K于56℃水浴消化10 mg胃癌組織后使用酚氯仿法抽提和純化基因組DNA。因miR-146a PCR產(chǎn)物過短，難以分離回收，按文獻方法擴增其上下游序列，其中包含了miR-146a全長〔5〕。PCR擴增引物如下：上游引物：5'-ATTTTACAGGGCTGGGACAG-3';下游引物：5'-TCTTCCAAGCTCTTCAGCAG-3'，產(chǎn)物長度：227 bp。將PCR產(chǎn)物電泳、切膠回收后送Invitrogen公司測序，測序引物為PCR擴增體系的上游引物。

1.2.2 miR-146a表達測定 使用real-time PCR方法測定miR-146a在組織中的表達：①將組織在Trizol中低溫勻漿，后使用氯仿抽提總RNA;再使用ABI公司miR-146a試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄〔6〕。②使用上述miR-146a試劑盒進行real-time PCR擴增;以2-△△CT法分析數(shù)據(jù)。使用U6作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SDPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，描述正態(tài)分布數(shù)據(jù)以s表示，以頻數(shù)和百分數(shù)描述計數(shù)資料，使用基于Pearson χ2檢驗的方法判斷對照組人群是否符合Hardy-Weinberg平衡定律;計數(shù)資料比較使用Pearson χ2檢驗;miR-146a在各種基因型表達差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法校正，胃癌患者癌組織與其自身正常組織miR-146a表達量差異使用配對t-檢驗;miR-146a表達量在轉(zhuǎn)移與否的胃癌患者癌組織中的差異比較采用成組t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 納入人群臨床特征 兩組患者年齡、性別等基線資料比較，差異無顯著性，具有可比性;肝腎功能等在兩組中存在顯著性差異。Hardy-Weinberg平衡定律顯示對照組基因型分布符合Hardy-Weinberg定律(P=0.78)。見表1。

2.2 胃癌患者與正常對照miR-146a基因型分布差異 miR-146a基因型分布在胃癌組和對照組中存在差異，表現(xiàn)為GG及GC基因型比例高而胃癌基因型比例低;χ2檢驗顯示該差異存在統(tǒng)計學意義(P=0.03)。以胃癌患者或正常對照為因變量，以年齡、性別、肝腎功能、吸煙狀況及基因型為自變量進行Lo-gistic回歸分析，結(jié)果顯示GG及GC基因型是胃癌的危險因素之一(GG 基因型：OR=1.26，95%CI：1.06 ～1.46;P ＜0.01;GC基因型，OR=1.15，95%CI：1.03 ～1.27;P=0.02)，即攜帶 GG基因型使胃癌發(fā)病風險增加26%，而GC基因型攜帶者胃癌發(fā)病風險增加15%。

按有無轉(zhuǎn)移將結(jié)腸癌患者分為兩組，分別設為T1轉(zhuǎn)移組(n=26)及T0無轉(zhuǎn)移組(n=60)。轉(zhuǎn)移組患者GG基因型比例顯著高于無轉(zhuǎn)移組，GC基因型比例亦略高于無轉(zhuǎn)移組。χ2檢驗顯示兩組基因型分布存在統(tǒng)計學差異，Logistic回歸分析顯示攜帶GG基因使轉(zhuǎn)移風險增加60.5%(OR=1.61，95%CI：1.00～1.76;P ＜0.042);攜帶GC基因型并不增加轉(zhuǎn)移風險(OR=1.08，95%CI：0.88 ～1.25，P=0.58)。見表2。

為進一步探討miR-146a基因多態(tài)性是否與其成熟體miR-146a表達量有關，使用real-time PCR方法檢測并比較了對照組中不同基因型中miR-146a表達量差異。GG和GC基因型人群miR-146a表達量均低于胃癌基因型，而GG與GC基因型攜帶者miR-146a表達量差異無統(tǒng)計學意義。表明miR-146a基因多態(tài)位點中的G等位基因可能是顯性基因，介導miR-146a負性調(diào)節(jié)。

表1 納入人群臨床特征(s)

表1 納入人群臨床特征(s)

項目 胃癌組(n=86)對照組(n=42)P值60.20±12.18 62.16±10.64 0.38男/女(n)40/46 23/19 1.20吸煙〔n(%)〕 25(29.1)12(28.6)0.73肝功能谷丙轉(zhuǎn)氨酶(U/L)106.39±34.58 20.13±3.64 ＜0.01谷草轉(zhuǎn)氨酶(U/L)99.21±60.05 15.46±4.06 ＜0.01血肌酐(μmol/L)168.20±36.22 42.68±9.43 ＜0.01基因型分布〔n(%)〕GG 20(23.3)6(14.3)0.03 GC 44(51.2)19(43.2)胃癌〔n(%)〕 14(16.3)14(33.3)年齡(歲)

表2 胃癌轉(zhuǎn)移與否人群基本特征

2.3 miR-146a在胃癌患者中的表達 上述結(jié)果證明GG基因型與胃癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移有關，且G等位基因與miR-146a表達減少有關，為進一步探討miR-146a表達量在胃癌組織中是否降低，使用real-time PCR方法檢測并比較miR-146a在胃癌組織及胃癌患者正常組織的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與患者自身正常胃黏膜組織比較，胃癌組織miR-146a表達量減少。且轉(zhuǎn)移組患者miR-146a表達進一步減少，表明miR-146a與胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移有相關性。

3 討論

早有實驗報道m(xù)iR-146a在甲狀腺腫瘤、胰腺腫瘤及胃癌中可能發(fā)揮作用，本研究主要觀察miR-146a基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病相關;進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-146a基因多態(tài)性與miR-146a表達量相關，而后者在胃癌患者表達量升高。這些研究結(jié)果提示miR-146a基因多態(tài)性及miR-146a表達量在胃癌發(fā)生發(fā)展起作用。

miR-146a多態(tài)性除與癌癥發(fā)生有關外，似乎與轉(zhuǎn)移關系更為密切。已經(jīng)證明的miR-146a的靶基因主要有兩個：表皮生長因子受體(EGFR)及白細胞介素受體相關激酶1(IRAK1)〔8〕。這兩個蛋白質(zhì)作用機制相對獨立，但均系影響腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要蛋白。EGFR作為miR-146a靶基因，已被證明在胃癌組織中得到上調(diào)〔9〕，支持本研究結(jié)果。EGFR在結(jié)構(gòu)及功能上與某些癌基因頗為相似，如通過EGF-EGFR-Raf-ERK信號通路促進細胞增殖;EGFR受激動時還可直接激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)，從而激活 NF-κB信號通路，而后者在惡性腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移中已得到充分論證。同時，已有研究顯示EGFR可通過ERK及p38信號通路直接調(diào)節(jié)金屬基質(zhì)蛋白酶9活性，而后者作為腫瘤轉(zhuǎn)移的重要物質(zhì)亦基本得到公認〔10，11〕。相對于EGFR，IRAK1作用機制相對簡單，IRAK1是NF-κB上游蛋白，可直接激活 NF-κB，從而參與調(diào)節(jié)胃癌發(fā)生發(fā)展〔12〕。因此，結(jié)合已有研究結(jié)果及本研究結(jié)論，支持miR-146a基因多態(tài)性→miR-146a表達量→EGFR及IRAK1表達量這一途徑在胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移中起重要作用。

本研究存在一定缺陷，如實驗主要是病例對照研究，缺乏長期隨訪，因而實驗結(jié)果可能需要前瞻性隊列研究來提供更多信息。另外，本研究樣本量相對較小，可能會使研究結(jié)論受到隨機誤差的影響。但實驗揭示了miR-146a基因多態(tài)性與胃癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移的關系，同時提示miR-146a基因多態(tài)性對胃癌的影響可能是通過miR-146a基因多態(tài)性→miR-146a表達量→EGFR及IRAK1表達量這一途徑實現(xiàn)的〔13〕。隨著研究的深入和技術的進步，相信miRNA在胃癌的發(fā)生機制上將取得突破性進展，從而為胃癌的診斷、靶基因治療和預后預測等提供新的方法和依據(jù)。

1 Xu J，Qin X，Wang J，et al.Chinese guidelines for the diagnosis and comprehensive treatment of hepatic metastasis of colorectal cancer〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2011;137(9)：1379-96.

2 Grávalos Castro C，Maurel Santasusana J，Rivera Herrero F，et al.SEOM clinical guidelines for the adjuvant treatment of colorectal cancer〔J〕.Clin Transl Oncol，2010;12(11)：724-8.

3 宋 莉，王澤劍.MicroRNAs的研究方法學及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系的研究進展〔J〕.中國腫瘤生物治療雜志，2007;14(1)：397-8.

4 Kogo R，Mimori K，Tanaka F，et al.Clinical significance of miR-146a in gastric cancer cases〔J〕.Clin Cancer Res，2011;117(13)：4277-84.

5 Xiao B，Guo J，Miao Y，et al.Detection of miR-106a in gastric carcinoma and its clinical significance〔J〕.Clin Chim Acta，2009;400(1-2)：97-102.

6 Xu B，F(xiàn)eng NH，Li PC，et al.A functional polymorphism in Pre-miR-146a gene is associated with prostate cancer risk and mature miR-146a expression in vivo〔J〕.Prostate，2010;70(5)：467-72.

7 Zhang Y，Li M，Wang H，et al.Profiling of 95 microRNAs in pancreatic cancer cell lines and surgical specimens by real-time PCR analysis〔J〕.World J Surg，2009;33(4)：698-709.

8 Symowicz J，Adley BP，Gleason KJ，et al.Engagement of collagen-binding integrinspromotes matrix metalloproteinase-9-dependentE-cadherin ectodomain shedding in ovarian carcinoma cells〔J〕.Cancer Res，2007;67(5)：2030-9.

9 Cowden DKD，Symowicz J，Ning Y，et al.Matrix metalloproteinase 9 is a mediator of epidermal growth factor-dependent e-cadherin loss in ovarian carcinoma cells〔J〕.Cancer Res，2008;68(12)：4606-13.

10 Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2008;105(30)：10513-8.

11 Siva AC，Nelson LJ，F(xiàn)leischer CL，et al.Molecular assays for the detection of microRNAs in prostate cancer〔J〕.Mol Cancer，2009;8：17.

12 葉耿泰，蔡建春.胃癌重要的調(diào)控因子-microRNAs〔J〕.醫(yī)學綜述，2011;17(9)：1324-5.

13 陳榮新，葉勝龍.MicroRNAs與腫瘤的研究進展〔J〕.國際外科學雜志，2007，34(3)：123-9.