趙玲，趙春才，楊博，劉艷艷，施琳

（1.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，武漢4 3 0 0 2 3；2.南京科瑞翔醫(yī)藥科技有限公司，南京 2 1 0 0 1 9；3.南京安格醫(yī)藥化工有限公司，南京 2 1 0 0 0 9）

HPLC法測(cè)定鹽酸帕唑帕尼片含量和有關(guān)物質(zhì)

趙玲1＊，趙春才2，楊博3，劉艷艷2，施琳2

（1.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，武漢4 3 0 0 2 3；2.南京科瑞翔醫(yī)藥科技有限公司，南京 2 1 0 0 1 9；3.南京安格醫(yī)藥化工有限公司，南京 2 1 0 0 0 9）

目的：建立測(cè)定鹽酸帕唑帕尼片中主藥和有關(guān)物質(zhì)含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Kromasil C18，流動(dòng)相為乙腈-0.0 2 mol·L－1醋酸銨緩沖液（3 5∶6 5），流速為1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為2 6 8 nm，柱溫為2 5℃，進(jìn)樣量為2 0 μL。結(jié)果：鹽酸帕唑帕尼檢測(cè)濃度線性范圍為4 0.1 8～3 6 1.6μg·mL－1（r＝0.9 9 99），檢測(cè)限為2ng，平均回收率為9 9.6 0%，RSD＝0.5 3%（n＝9）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、可靠，可用于鹽酸帕唑帕尼片的質(zhì)量控制。

鹽酸帕唑帕尼片；有關(guān)物質(zhì)；含量測(cè)定；高效液相色譜法

鹽酸帕唑帕尼（Pazopanib hydrochloride，PH）是由葛蘭素史克公司研制開發(fā)的第2代多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，商品名為Votrient，2 0 0 9年1 0月1 9日由美國(guó)FDA宣布批準(zhǔn)上市，用于晚期腎癌的治療[1]。目前其上市劑型有片劑，但該制劑的含量及有關(guān)物質(zhì)測(cè)定國(guó)內(nèi)未見文獻(xiàn)報(bào)道。為此，筆者建立了測(cè)定PH片含量的高效液相色譜（HPLC）法，以為其質(zhì)量評(píng)價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

HPLC儀，包括LC-1 0 ATvp泵、SPD-1 0 Avp紫外檢測(cè)器、N2 0 0 0色譜工作站、UV-2 4 0 1 PC紫外-可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）。

PH片（批號(hào)：1 1 0 3 2 2 1、1 1 0 3 2 2 2、1 1 0 3 2 2 3，規(guī)格：每片2 0 0 mg）、PH對(duì)照品（由批號(hào)為1 1 0 3 0 7的原料藥精制而成，純度：9 9.8 3%）及中間體Ⅰ[N-（2-氯嘧啶-4-基）-2，3-二甲基-2 H-吲哚-6-胺]、中間體Ⅱ[2，3-二甲基-N-（2-氯嘧啶-4-基）-N-甲基-2 H-吲哚-6-胺]均由南京科瑞翔醫(yī)藥科技有限公司提供；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（2 5 0 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.0 2 mol·L－1醋酸銨緩沖液（1.5 4 3 g醋酸銨，溶于1 0 0 0 mL水中）（3 5∶6 5），流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：2 6 8 nm；柱溫：2 5℃；進(jìn)樣量：2 0 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品與對(duì)照品溶液。取PH片粉末適量，約相當(dāng)于PH 2 0 mg，精密稱定，置于1 0 0 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；另取PH對(duì)照品，同法用流動(dòng)相溶解并制成0.2 mg·mL－1的溶液作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 有關(guān)物質(zhì)溶液。取PH片粉末適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成PH濃度為0.2 mg·mL－1的溶液作為供試液；取供試液適量，用流動(dòng)相稀釋制成2 μg·mL－1的溶液作為對(duì)照液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品、供試品溶液各2 0 μL，并以空白輔料的流動(dòng)相溶液作為陰性對(duì)照，分別進(jìn)樣分析。結(jié)果，PH的理論板數(shù)為8 5 9 4，保留時(shí)間為8.4 0 2 min，峰形對(duì)稱，詳見圖1。

2.4 線性關(guān)系與檢測(cè)限考察

取PH對(duì)照品，用流動(dòng)相溶解并稀釋成濃度分別為4 0.1 8、1 2 0.5、2 0 0.9、2 8 1.3、3 6 1.6 μg·mL－1的溶液，分別精密量取上述溶液進(jìn)樣，記錄色譜。以濃度（c）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝－2.5 2 49×1 04+2.4 6 15×1 04c（r＝0.9 9 99，n＝5）。結(jié)果表明，PH檢測(cè)濃度的線性范圍為4 0.1 8～3 6 1.6μg·mL－1。以信噪比S/N＝3計(jì)算，得檢測(cè)限為2 ng。

2.5 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定。結(jié)果，峰面積值RSD＝0.2 7%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同批樣品6份，制備成供試品溶液，進(jìn)樣分析，測(cè)定每份樣品的含量，結(jié)果平均含量為9 9.1 3%，RSD＝0.3 0%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液1份，在0、1、2、4、8 h時(shí)分別進(jìn)樣，結(jié)果以峰面積計(jì)算RSD＝0.2 8%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn)

取同批樣品，按測(cè)試濃度的8 0%、1 0 0%、1 2 0%3個(gè)梯度分別加入PH對(duì)照品，進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果詳見表1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖A.空白輔料；B.對(duì)照品；C.供試品；1.PHFig 1 HPLC chromatograms of system suitability test A.blank excipients；B.substance control；C.test sample；1.PH

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（n＝9）

2.9 中間體分離試驗(yàn)及破壞性試驗(yàn)

取PH對(duì)照品及中間體Ⅰ、Ⅱ用流動(dòng)相制成每1 mL中含PH 2 0 0 μg、中間體Ⅰ2 0 μg、中間體Ⅱ2 0 μg的溶液，作為中間體分離試驗(yàn)的供試品溶液。另取PH片粉末（約相當(dāng)于PH 1 mg）各3份，分別置于1 0 mL量瓶中，第1份加0.1 mol·L－1的鹽酸1 mL；第2份加0.1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液1 mL；第3份加3%的雙氧水1 mL。靜置2 h后，第1份加0.1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液1 mL中和后，加流動(dòng)相稀釋至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為酸破壞后的供試品溶液；第2份加0.1mol·L－1的鹽酸1 mL中和后，加流動(dòng)相稀釋至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為堿破壞后的供試品溶液；第3份加流動(dòng)相稀釋至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為氧化破壞后的供試品溶液。取上述各供試品溶液進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果各中間體的峰與主峰能完全分離，酸、堿破壞沒(méi)有產(chǎn)生明顯的降解產(chǎn)物，氧化破壞有明顯的降解產(chǎn)物，且各降解產(chǎn)物都能與主成分完全分離。中間體分離及氧化破壞后溶液色譜圖見圖2。

圖2 中間體分離及氧化破壞試驗(yàn)高效液相色譜圖A.中間體分離試驗(yàn)供試品；B.氧化破壞后供試品Fig 2 HPLC chromatograms of intermediate separation and destructive oxidation test A.test sample of intermediates separation test；B.test sample of destructive oxidation test

2.10 樣品含量測(cè)定

主藥含量的測(cè)定：取PH片粉末及PH對(duì)照品適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法分別制備成供試品、對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，記錄峰面積，并按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。結(jié)果3批樣品含量分別為9 9.1 3%、9 9.4 9%、9 8.9 4%。

有關(guān)物質(zhì)含量的測(cè)定：取PH片粉末適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試液和對(duì)照液。量取對(duì)照液2 0 μL注入色譜儀，調(diào)節(jié)儀器檢測(cè)靈敏度，使PH峰的峰高為滿量程的1 0%～3 0%；再量取供試液2 0 μL注入色譜儀，記錄色譜至主峰保留時(shí)間的3倍，記錄主峰和有關(guān)物質(zhì)的峰面積，按1%自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的含量。結(jié)果3批樣品中有關(guān)物質(zhì)含量分別為0.2 8%、0.3 3%、0.2 5%。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取PH對(duì)照品、供試品、中間體和輔料溶液，按紫外分光光度法[2]操作，于1 9 0～4 0 0 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果，對(duì)照品、供試品溶液均于2 1 0、2 6 8、3 2 3 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，合成反應(yīng)各步的中間體于2 6 8 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，輔料溶液在此處無(wú)吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)選為2 6 8 nm。

3.2 流動(dòng)相的選擇

通過(guò)對(duì)PH、各中間體及破壞后樣品的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.0 2 mol·L－1醋酸銨緩沖液（3 5∶6 5）為流動(dòng)相時(shí)，主成分峰形對(duì)稱，與其有關(guān)物質(zhì)、各步中間體和降解產(chǎn)物均能得到很好的分離。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、可靠，可用于PH片的質(zhì)量控制。

[1] FDA.FDA approves new treatment for advanced form of kidney cancer[EB/OL].http：//www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm1 8 7 1 7 4.htm.2 0 0 9-1 0-1 9.2 0 1 1-0 8-1 4.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2 0 1 0年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2 0 1 0：附錄ⅣA.

Content Determination of Main Component and Related Substances in Pazopanib Hydrochloride Tablets by HPLC

ZHAO Ling（School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 4 3 0 0 2 3，China）
ZHAO Chun-cai，LIU Yan-yan，SHI Lin（Nanjing Keruixiang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Nanjing 2 1 0 0 1 9，China）YANG Bo（Nanjing Ange Pharmaceutical Co.，Ltd.，Nanjing 2 1 0 0 0 9，China）

OBJECTIVE：To develop a method for the content determination of main component and related substances in Pazopanib hydrochloride tablets.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Kromasil C18column with mobile phase composed of acetonitrile-0.0 2mol·L－1ammonium acetate solution（3 5∶6 5）at the flow rate of 1.0mL·min－1.The detection wavelength was set at 2 6 8nm at 2 5℃.The injection size was 2 0μL.RESULTS：The linear range of pazopanib hydrochloride was 4 0.1 8～3 6 1.6μg·mL－1（r＝0.9 9 99）.The detection limit was 2ng and average recovery rate was 9 9.6 0%（RSD＝0.5 3%，n＝9）.CONCLUSION：The method is simple，rapid，accurate and reliable，and it is applicable for the quality control of Pazopanib hydrochloride tablets．

Pazopanib hydrochloride tablets；Related substance；Content determination；HPLC

R9 2 7.2

A

1 0 0 1-0 4 0 8（2 0 1 2）3 3-3 1 3 8-0 2

DOI1 0.6 0 3 9/j.issn.1 0 0 1-0 4 0 8.2 0 1 2.3 3.2 6

＊講師，博士。研究方向：天然藥物化學(xué)、藥物化學(xué)。電話：0 2 7-8 3 9 5 6 7 9 3。E-mail：zhaolingcpu@1 2 6.com

2 0 1 1-0 9-1 9

2 0 1 1-1 0-2 6）