孫 悅，唐素芳（天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 3 0 0 0 7 0）

流通池法測(cè)定尼古丁緩釋貼劑的釋放度

孫 悅＊，唐素芳（天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 3 0 0 0 7 0）

目的：建立測(cè)定尼古丁緩釋貼劑中尼古丁釋放度的方法。方法：采用流通池法，并與原研廠采用的碟上槳法進(jìn)行結(jié)果比較。流通池法測(cè)定條件：釋放介質(zhì)為0.0 0 1 5 mol·L－1磷酸水溶液，流速為4 mL·min－1，層流流動(dòng)方式；采用高效液相色譜法測(cè)定尼古丁的釋放度；用模型法零級(jí)、一級(jí)、Higuchi方程等和相似因子法分別對(duì)不同釋放介質(zhì)的釋放曲線進(jìn)行擬合，提取釋放參數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：建立的流通池法與碟上槳法測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異（P＞0.0 5）。結(jié)論：所建立的方法簡(jiǎn)便、可行，為緩釋貼劑釋放度測(cè)定方法提供了一種新的選擇，并可用于相關(guān)制劑的質(zhì)量控制。

流通池法；尼古??；緩釋貼劑；釋放度；模型法；相似因子法

流通池法（Flow-through cell method）也曾被稱(chēng)為流池法[1]（Flow-cell method），是有別于槳法、籃法等傳統(tǒng)溶出度測(cè)定的一種新的溶出測(cè)定方法，在《美國(guó)藥典》（USP）（3 4）、《英國(guó)藥典》（BP）（2 0 1 1）、《日本藥局方》（第十五版）的附錄中的溶出度測(cè)定方法項(xiàng)下均有收載。目前，透皮緩釋貼劑的應(yīng)用越來(lái)越多，而其體外測(cè)定方法是在近年來(lái)才出現(xiàn)的，方法尚不成熟?！吨袊?guó)藥典》[2]現(xiàn)采用碟上槳法，但其在應(yīng)用上受很大限制，如果溶出介質(zhì)的量低于5 0 0 mL，就無(wú)法應(yīng)用該法，因?yàn)闃纳涎貢?huì)從溶媒中露出。特別是對(duì)于目前的溶出度儀來(lái)說(shuō)，采用碟上槳法后無(wú)法自動(dòng)取樣，操作非常復(fù)雜。因此，開(kāi)發(fā)一種適合貼劑釋放度測(cè)定的新方法就顯得格外重要。本試驗(yàn)以用于緩解煙癮的尼古丁緩釋貼劑為研究對(duì)象，建立了對(duì)其進(jìn)行體外釋放度測(cè)定的流通池法，與原研廠方法（碟上槳法）測(cè)定結(jié)果經(jīng)模型法和相似因子（f2）法[3]比較，結(jié)果均一致。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CE7 Offline流通池法溶出度儀，包括SOTAX CE7主機(jī)、CY7-5 0活塞泵（瑞士Sotax公司）；1 1 0 0型高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)Agilent公司）。

1.2 試藥

尼古丁緩釋貼劑（批號(hào)：0 6 1 9 3 4 5 1 B，規(guī)格：每片1 4 mg）、酒石酸尼古丁對(duì)照品（批號(hào)：0 8 1 1 0 2 6，純度：1 0 0.0%，以酒石酸尼古丁計(jì)）均由中美天津史克制藥有限公司提供；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

生物半透膜（上海綠島生物科技有限公司，截留分子量：1 0 0 0）。

1.3 流通池法溶出度儀試驗(yàn)裝置

流通池法溶出度儀有7個(gè)流通池；試驗(yàn)中，溶媒貯放瓶中的釋放介質(zhì)經(jīng)活塞泵從每個(gè)流通池的底部注入，與流通池中的樣品接觸后，從流通池頂端濾過(guò)系統(tǒng)回到溶媒貯放瓶中，濾過(guò)系統(tǒng)由1個(gè)篩網(wǎng)和1片玻璃纖維過(guò)濾膜組成。在流通池底部的錐形部中可加入一定量直徑1 mm的玻璃珠以改變釋放介質(zhì)的流動(dòng)狀態(tài)。流通池結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1。

圖1 流通池結(jié)構(gòu)圖Fig 1 Structure of flow-through cell

圖2 貼劑測(cè)定池示圖Fig 2 Diagrammatic sketch of patch cell

由于流通池法還沒(méi)有應(yīng)用于貼劑測(cè)定，所以目前還沒(méi)有專(zhuān)用的貼劑測(cè)定池。本文將用于軟膏測(cè)定的膏劑測(cè)定池略作改動(dòng)，將圓形池身的直徑加大改制，作為貼劑測(cè)定池，見(jiàn)圖2。

試驗(yàn)時(shí)將貼劑剪成直徑略小于貼劑測(cè)定池直徑大小的樣品，置于池中，上面用生物半透膜罩住，用箍將其固定，放入流通池片夾位置，即完成。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶出度的測(cè)定

2.1.1 色譜條件。色譜柱為Rainin C18（5 0 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為4 0℃；流動(dòng)相為乙腈-水（含0.0 5 5%（W/V）十二烷基磺酸鈉、0.0 2%（V/V）二甲基辛胺、0.0 2%（V/V）冰醋酸、0.0 2%（W/V）無(wú)水醋酸鈉）（2 2∶7 8），流速為1 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)為2 5 4 nm；進(jìn)樣量為5 0 μL。在此色譜條件下，取“2.1.4”項(xiàng)下對(duì)照品溶液（1 1 2 μg·mL－1）和“2.1.8”項(xiàng)下2 4 h的溶出液進(jìn)樣分析。結(jié)果，尼古丁峰的保留時(shí)間為2 min，理論板數(shù)約為1 5 6 3，溶媒與貼劑中其他物質(zhì)不干擾測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 高效液相色譜圖A.對(duì)照品溶液；B.2 4 h的溶出液；1.尼古丁Fig 3 HPLC chromatograms A.substance control；B.released solution at 2 4 h；1.nicotine

2.1.2 釋放介質(zhì)的選擇。原研廠采用的釋放介質(zhì)是0.0 1 5 mol·L－1磷酸水溶液（pH 2.0），而根據(jù)文獻(xiàn)[4]顯示，皮膚的pH值在5.0左右，呈微酸性，因此本試驗(yàn)先后嘗試了水、0.0 1 5 mol·L－1磷酸水溶液、0.0 0 1 5 mol·L－1磷酸水溶液、pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）、pH4.0醋酸鹽緩沖液、pH6.8 PBS這6種介質(zhì)。其中后2種介質(zhì)使貼劑的背襯層溶解，干擾了測(cè)定，故不予考慮。其余4種介質(zhì)所得結(jié)果經(jīng)方差分析及相似因子計(jì)算，結(jié)果以0.0 0 1 5 mol·L－1磷酸水溶液為介質(zhì)所得結(jié)果與碟上槳法一致，故選取其作為釋放介質(zhì)。5種釋放介質(zhì)中的溶出曲線見(jiàn)圖4。

圖4 5種釋放介質(zhì)中尼古丁溶出曲線Fig 4 Release curves of nicotine in 5kinds of medium

2.1.3 貯備液制備。精密稱(chēng)取酒石酸尼古丁對(duì)照品適量，置于5 0 mL量瓶中，用0.0 0 1 5 mol·L－1磷酸水溶液（pH 5.0）溶解并稀釋定容至刻度，制成1.4 mg·mL－1對(duì)照品貯備液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。精密量取“2.1.3”項(xiàng)下貯備液適量，置于5 0 mL量瓶中，用0.0 0 1 5 mol·L－1磷酸水溶液稀釋至刻度，分別制備成濃度為2 8、5 6、8 4、1 1 2、1 4 0、2 8 0 μg·mL－1的系列對(duì)照品溶液，進(jìn)樣5 0 μL。以峰面積（A）對(duì)濃度（c）進(jìn)行回歸，結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 A＝5.7 6 33 c－1.5 5 74（r＝0.9 9 99，n＝6）。尼古丁檢測(cè)濃度線性范圍為2 8～2 8 0 μg·mL－1。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn)。取尼古丁緩釋貼劑，剪碎，稱(chēng)取適量（約含尼古丁2.2 5 mg），共9份，精密稱(chēng)定，分別置于5 0 mL量瓶中，精密加入對(duì)照品貯備液3.0、4.0、5.0 mL各3份，加0.0 0 1 5 mol·L－1磷酸水溶液溶解稀釋至刻度，搖勻，制備成含對(duì)照品相當(dāng)于檢查限度6 0%、8 0%、1 0 0%的樣品溶液。用0.4 5 μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣分析，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程測(cè)定尼古丁含量，計(jì)算上述3個(gè)濃度點(diǎn)的平均回收率（n＝3）。結(jié)果分別為9 8.9%、9 9.7%、9 9.2%，RSD分別為0.4 9%、0.2 2%、0.3 0%。

2.1.6 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)。取“2.1.4”項(xiàng)下濃度為1 4 0 μg·mL－1對(duì)照品溶液5 0 μL，分別于0、4、8、1 6、2 4 h進(jìn)樣，測(cè)定尼古丁峰的峰面積，計(jì)算RSD（n＝5），結(jié)果為0.3 8%；再取此對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果，RSD＝0.1 2%。表明此方法具有良好穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.1.7 釋放度測(cè)定。采用流通池法閉合系統(tǒng)裝置，每次試驗(yàn)取樣品6片，置于錐形部裝滿(mǎn)1 mm玻璃珠（約6.3 g）的流通池內(nèi)，使溶出介質(zhì)在流通池內(nèi)以層流方式流動(dòng)，釋放介質(zhì)經(jīng)脫氣處理，體積為1 0 0mL，活塞泵流速4mL·min－1，溫度3 2.0℃（與皮膚溫度接近），啟動(dòng)活塞泵，自釋放介質(zhì)浸過(guò)樣品時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別于0、2、4、8、1 2、2 4 h（與碟上槳法取樣時(shí)間對(duì)應(yīng)）各取樣2 mL，同時(shí)補(bǔ)充等溫等體積的釋放介質(zhì)，取濾液5 0 μL進(jìn)行色譜分析。

2.1.8 測(cè)定結(jié)果。分別采用原研廠碟上槳法（介質(zhì)是0.0 1 5 mol·L－1磷酸水溶液）及本文所建立的流通池法對(duì)尼古丁緩釋貼劑進(jìn)行測(cè)定，其中流通池法采用pH 7.4 PBS、0.0 1 5 mol·L－1磷酸水溶液、水及0.0 0 1 5 mol·L－1磷酸水溶液（分別用A、B、C、D、E代表上述5種釋放介質(zhì)對(duì)應(yīng)的方法）。累積釋放度結(jié)果見(jiàn)表1。

表15種方法尼古丁釋放度測(cè)定結(jié)果（%%，n＝6）Tab 1Release rates of nicotine by 5 kinds of methods（%%，n＝6）

2.2 數(shù)據(jù)擬合

對(duì)上述結(jié)果分別采用模型法[5]和f2法進(jìn)行分析，其中，模型法分別采用了緩釋制劑常用的零級(jí)、一級(jí)及Higuchi方程進(jìn)行擬合，此外，也用Weibull分布方程進(jìn)行了擬合。結(jié)果，擬合優(yōu)度的順序由高到低依次為Higuchi方程（r＝0.9 8 0 5）、零級(jí)方程（r＝0.9 7 65）、一級(jí)方程（r＝0.9 5 73）、Weibull分布方程（r＝0.9 3 2 1）。因此選擇Higuchi方程作為模型法使用的方程，Higuchi方程可簡(jiǎn)化為：F（t）/F∞＝kt1/2。通過(guò)Higuchi方程提取參數(shù)Td、T50進(jìn)行方差分析和多重比較檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，A、E與B、C、D方法間有極顯著性差異（P＜0.0 1），其中原研廠碟上槳法（A）與E法之間無(wú)顯著性差異（P＞0.0 5），這與f2法的計(jì)算結(jié)果一致。2種分析方法比較結(jié)果見(jiàn)表2（自由度：組間＝4，組內(nèi)＝2 5）。

3 討論

目前，進(jìn)行緩釋制劑的釋放度評(píng)價(jià)一般采用2種方法，一是模型法，二是非模型依賴(lài)法。緩釋制劑的模型有一級(jí)方程和Higuchi方程，但當(dāng)需要計(jì)算的量比較小時(shí)，使用模型法提取釋放參數(shù)在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)比較煩瑣，可采用非模型依賴(lài)法中的相似因子法進(jìn)行替代。相似因子法計(jì)算相對(duì)簡(jiǎn)便，而且結(jié)果可靠，是美國(guó)FDA推薦使用的方法[6]。其基本原理是基于生物等效性的基本假設(shè)進(jìn)行體外釋放度的等效性評(píng)價(jià)。相似因子法計(jì)算的基本假設(shè)是試驗(yàn)藥品與對(duì)照藥品的累積釋放度差的平方和最小，如果5 0≤f2≤1 0 0，則表示2種制劑的釋放度相似。

隨著制劑技術(shù)的飛速發(fā)展、大量新劑型的誕生以及目前對(duì)于溶出度測(cè)定方法體內(nèi)外相關(guān)性（IVIVC）的要求，傳統(tǒng)的釋放度測(cè)定方法（槳法、籃法等）在進(jìn)行制劑質(zhì)量控制時(shí)遇到了許多新的問(wèn)題和難題，比如說(shuō)微量藥物制劑的測(cè)定，貼劑、微球劑等新劑型的測(cè)定以及如何解決速釋制劑體內(nèi)外相關(guān)性等。而流通池法作為一種新型的釋放度檢查方法，不僅在傳統(tǒng)劑型片劑、膠囊劑中有著廣闊的應(yīng)用前景，而且在貼劑、藥物釋放支架、混懸劑、植入劑及微球、脂質(zhì)體等新劑型中更是具有很大的實(shí)用價(jià)值，可以很好地彌補(bǔ)傳統(tǒng)釋放度方法的不足。

表2 不同分析方法擬合后的釋放度參數(shù)Tab 2 Release parameters fitted by different methods analysis

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Determination of Release Rate of Nicotine Sustained-release Patches by Flow-through Cell Method

SUN Yue，TANG Su-fang
（Tianjin Institute for Drug Control，Tianjin 3 0 0 0 7 0，China）

OBJECTIVE：To develop a method for the determination of the release rate of Nicotine sustained-release patches.METHODS：Flow-through cell method was compared with paddle plate method of the originator.0.0 0 15mol·L－1phosphoric acid solution was used as the medium at the flow rate of 4mL·min－1in laminar flow mode.HPLC method was used to determine the release rate of nicotine.Model method such as zero-order，one-order，Higuchi equations and similarity factor method were used to fit the release curves of nicotine in different medium.The main parameters were calculated and analyzed statistically.RESULTS：The results of flow-through cell method was consistent with that of paddle plate method（P＞0.0 5）.CONCLUSION：The established method is simple and convenient，and it can be used as a new choice to determine the release rate of sustained-release patch and quality control of those dosage forms.

Flow-through cell method；Nicotine；Sustained-release patch；Release rate；Model method；Similarity factor method

R9 2 7.1

A

1 0 0 1-0 4 0 8（2 0 1 2）3 3-3 1 3 3-0 3

DOI1 0.6 0 3 9/j.issn.1 0 0 1-0 4 0 8.2 0 1 2.3 3.2 4

2 0 1 2-0 2-1 3

2 0 1 2-0 4-1 0）